《Food Chemistry》新研究：一個探針“雙殺"，既能盯梢食品腐敗，又能海選產酸菌！
日常生活中，我們購買的生鮮肉從新鮮到腐敗，會經歷一個復雜的生化過程。而工業生產中，產酸菌又是許多重要產品的發酵引擎。如何既能實時追蹤食品腐敗的“元兇"——微生物代謝，又能高通量篩選出性能良好的產酸菌株？傳統方法往往顧此失彼，難以兩全。
近日，河南科技大學的研究團隊在食品科學領域頂刊《Food Chemistry》上發表了一項創新研究，開發了一種名為AXE的新型熒光探針，成功將實時監測與高通量篩選兩項艱巨任務合二為一，為我們提供了一個“一石二鳥"的智慧解決方案。下面，就讓我們一探究竟。
難點在哪？為什么要有新探針？
在介紹這款“神器"之前，我們先來看看現實中的技術瓶頸：
1. 環境太復雜，傳統探針“水土不服"：食品滲出液或發酵液是名副其實的“大雜燴"，含有高濃度鹽分、蛋白質等干擾物。傳統的商業熒光探針在其中要么信號不穩定，光穩定性差（有的連續照射30分鐘，熒光就衰減過半），要么分辨率低，無法精確定位。
2. 監測與篩選，難以兼顧的“魚與熊掌"：傳統方法中，要實時監測，通常缺乏時效性，無法反映動態變化；要高通量篩選，往往成本高、通量低，且需要繁瑣的基因改造或外加底物標記。兩者很難在一個平臺上同時實現。
3. 探針標準高：它必須在微生物代謝比較活躍的核心pH范圍（5.5-8.0）內有高靈敏度、快速響應，還要對細菌毫無毒性，堪稱“多面手"要求。
如何破局？AXE探針登場
研究團隊巧妙地設計并合成了一款基于喹啉的熒光探針——AXE。它的核心設計思路是“質子化開關"。
工作原理：AXE分子含有可被質子化的氮原子。當環境pH發生變化時，它會經歷可逆的質子化/去質子化，從而像一個“分子開關"一樣，控制著分子內電荷轉移（ICT）效率，進而改變其熒光強弱（圖1A）。簡單說，環境越酸，熒光越弱；環境越堿，熒光越強。
關鍵特性：
o 快！ 對pH變化的響應時間小于2分鐘（圖2F）。
o 準！ 在核心區間（pH 5.5-8.0）內，熒光強度與pH值呈現良好的線性關系（R2 > 0.99，圖2D）。
o 穩！ 對多達26類干擾物（包括金屬離子、蛋白質等）有較高的耐受性。
o 無毒！ 對測試的芽孢桿菌生長無顯著影響（圖4AB）。
圖1 (A) AXE的合成路線；(B) 固體狀態下的AXE；(C) DMSO溶液中的AXE；(D) 不同pH值PBS緩沖液中的AXE顯色與熒光變化
圖2 (A) 吸收光譜；(B) 熒光發射光譜；(C) pKa擬合曲線；(D) 線性關系；(E) pH循環可逆性；(F) 響應時間；(G) DFT計算揭示的電子結構變化
實戰一：盯梢豬肉腐敗的“V"形曲線
研究團隊將AXE應用于新鮮豬肉的保鮮監測。他們將豬肉分別儲存在4°C和-20°C下，并用AXE探針和傳統的pH電極同時記錄了10天的pH變化（圖3AB）。
結果非常驚人：
· -20°C冷凍組：pH值始終維持在5.9±0.3的穩定水平，肉類顏色保持鮮紅，抑菌效果出色。
· 4°C冷藏組：AXE探針清晰地捕捉到一條“V字形"的pH軌跡！先是從6.2下降至5.8（微生物產酸主導），隨后又開始回升，最終超過了6.8的腐敗閾值。這個pH反彈點恰與肉眼可見的變褐、異味產生的時間點相吻合。更重要的是，AXE探針在pH開始回升的第三天就能發出預警，比肉眼觀察到明顯腐敗（第七天）足足早了4-5天！
圖3 (A) 探針AXE實時監測豬肉腐敗過程pH變化；(B) 熒光法與電極法的統計驗證；(C) -20°C與4°C下豬肉的感官變化（顏色與氣味）
實戰二：海選“產酸小能手"
AXE的另一大亮點在于其優秀的篩選能力。研究團隊將其與液滴微流控技術聯用，構建了一個高通量篩選平臺。
1. 液滴封裝：將待篩選的細菌和一定濃度的AXE探針一同封裝在皮升級的微小液滴中（圖4CE）。
2. 培養與識別：培養24小時后，產酸菌會降低液滴內pH，導致AXE熒光淬滅；而不產酸菌所在液滴則保持高熒光。
3. 海選分揀：利用熒光激活液滴分選（FADS）系統（圖4FG），在2,238,782個液滴中，精準地識別并分揀出16,714個低熒光的目標液滴（陽性率0.75%）。
4. 精篩與驗證：經過MISS cell系統二次培養和96孔板驗證，最終分離出11株產酸能力較強的芽孢桿菌（圖5）。其中，代表菌株22C展現出了驚人的產酸能力，在6小時內將培養基pH從7.6降至4.6，降低了整整3.0個pH單位！（圖6D）。
圖4 (A&B) DMSO和探針AXE的細胞毒性評估；(C) AXE熒光衰減與產酸的關系；(D&E) 液滴中細菌培養前后對比；(F) FADS分選直方圖；(G) 分選散點圖
圖5 96孔板高通量驗證：篩選出的11株高產酸菌株導致熒光強度顯著降低
圖6 11株高產酸菌株的生長與產酸動力學曲線
總結與展望
這項研究的核心成果是成功開發了一個集“實時pH監測"與“高通量菌株篩選" 于一體的雙功能平臺。其創新性在于：
· 一探兩用：同一款AXE探針，既能用于食品鏈條的“監測端"，也能用于工業菌種的“挖掘端"；
· 性能很好：其很強抗干擾、快速響應和免標記篩選的特點，解決了長久以來的技術痛點；
· 潛力巨大：理論上，該平臺可拓展用于其他產酸微生物（如乳酸菌）的監測和篩選，有望成為食品質量監控和工業微生物育種領域的有力工具。
這項研究不僅為理解食品腐敗的微觀機制提供了“實時直播"般的窗口，也為高產工業菌株的開發提供了“大海撈針"式的高效利器。未來，隨著技術的進一步優化，相信它將在保障食品安全、推動生物制造產業升級方面發揮重要作用。
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