鏡質合璧  還原真實

成像質譜顯微鏡用于米曲中磷脂和葡萄糖的可視化分析

引言

米曲是清酒釀造中的關鍵元素。它在清酒釀造中的主要作用被認為是提供分解淀粉和蛋白質的消化酶。米曲成品的成分對清酒的品質（味道和香氣）有很大的影響。然而，目前為止對米曲質量的評估經常依賴于釀酒師的經驗。這意味著此領域相關科學知識的不足，且仍有發展空間。當釀酒師評估米曲質量時，米曲的物理結構，即外觀和質地似乎是質量指標之一。 

在過去的研究中利用掃描電子顯微鏡來研究米曲的內部結構，但直到近幾年，評估米曲結構和成分關系的研究仍然進展甚微。由于島津iMScope成像質譜顯微鏡可同時觀察樣品結構和成分分布，在本應用報告中，我們將iMScope應用于發酵領域，并嘗試可視化分析米曲結構和成分分布。

如圖1所示，質譜成像（MSI）是非常適合觀察米曲結構以及決定其有效成分分布的技術。MSI應用于食品的論文，已有蘆筍中天冬酰胺和姜黃根中姜黃素分布可視化的應用報告⑴,⑵。本文針對食品科學研究中的“發酵"新應用領域，嘗試著將米曲內的結構和成分分布可視化。由于米曲非常易碎，在進行MSI分析時，未經前處理制作米曲切片幾乎是不可能的。因此，我們研究了各種切片制備方法，并成功實現從生米到蒸米和米曲過程中的代謝物可視化分析。

圖1 質譜成像（MSI）工作流程

實驗

2-1試劑

使用羧甲基纖維素（CMC）（FUJIFILM Wako）為包埋劑，配制濃度為4%的CMC水溶液，并將溶液放入70℃的恒溫箱過夜來確保*溶解。本實驗中使用的基質是α-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA）和N-(1-萘基)聚乙烯二胺二鹽酸鹽（NEDC）（Merck），溶劑為乙腈、異丙醇和甲醇（FUJIFILM Wako）、超純水。

2-2切片制備

使用清酒釀造用的拋光率為70%的山田錦大米（白鶴酒造株式會社）制成的蒸米和米曲。生米可視化研究中使用市售大米。如前所述，這些樣品材料極其脆弱。因此，采用冷凍切片機制備切片并使用粘性冷凍膜（cryo-lab）回收獲得的切片。將米粒包埋在上文所述的4%羧甲基纖維素溶液中，在-80℃冷凍。切片厚度為20 μm，獲得的薄膜利用導電雙面膠帶（3M公司）固定在ITO涂層玻璃載玻片上（無MAS涂層，表面電阻：100 Ω/m2）（松浪玻璃工業株式會社）（圖2）。

圖2 米曲切片制備

2-3基質涂敷

在檢測米粒切片和米曲切片中的磷脂時，使用島津iMLayer基質升華系統將CHCA沉積在樣品表面（圖3），接著噴涂CHCA溶液(3)。基質升華的膜厚度為0.5 μm。利用由乙腈、異丙醇、超純水（3: 1: 6）構成的含0.1 %甲酸的混合溶劑溶解CHCA，調節其濃度為10 mg/mL。已知可以有效電離葡萄糖的基質NEDC，利用iMLayer進行升華，升華時設置溫度為220℃、時間為10分鐘。NEDC基質升華后，利用5%甲醇溶液進一步進行重結晶。

圖3  iMLayer基質升華系統

2-4質譜成像

MSI檢測使用島津iMScope成像質譜顯微鏡進行。激光照射次數為100次/點。正離子模式檢測磷脂，空間分辨率為25 μm，負離子模式檢測葡萄糖，空間分辨率為50 μm。檢測范圍：正離子模式m/z　400-800，負離子模式m/z 180-230。在所有檢測中，激光強度均設置為45，檢測器電壓為2.1 kV。

2-5構建MS圖

數據分析和MS圖像構建采用島津MSI分析軟件Imaging MS Solution和IMAGEREVEAL MS進行。IMAGEREVEAL MS是通過統計學功能實現非靶向分析的軟件。它擁有校正函數（圖像過濾、像素插值），并含有“相似圖片提取"功能。本文后半部分所示的葡萄糖可視化數據是利用IMAGEREVEAL MS軟件進行分析。

結果

3-1生米、蒸米和米曲中磷脂的分布

圖4顯示了生米、蒸米和米曲切片中膽堿的分布。膽堿是一種在米曲制作過程中分布和數量會發生巨大變化的典型成分。生米的結果在碾米之前測得，且結果表明膽堿累積在大米胚芽中。在碾碎后的蒸米中，來自膽堿的峰急劇下降，但在米曲的內部則觀察到較強的峰。這表明膽堿在米曲發酵過程（即米曲制作過程）形成。因此，使用MSI 可以觀察到米曲制作過程中膽堿數量和空間分布發生急劇變化的現象。

圖4 生米、蒸米和米曲中膽堿的分布

在米曲的內部還觀察到各種磷脂（包括溶血磷脂）的累積（圖5）。尤其是溶血磷脂酰膽堿LPC（16:0），m/z 496.34和LPC（18:2），m/z 520.34顯示這一趨勢(4)。而磷脂m/z 748.35和786.30的MS圖像顯示出其在米曲中的不均勻分布。這種異質性被認為由曲霉（米曲霉，Aspergillus oryzae）侵入蒸米中生長出霧狀菌絲導致，這個過程就被稱為“hazekomi"。下一部分我們將介紹一種將hazekomi過程可視化的方法開發以及將這種方法與MSI結合使用的結果。

圖5 米曲（山田錦，稻米拋光率：70 %）中溶血磷脂和磷脂的分布

3-2hazekomi可視化及其與MSI的配合使用⑸,⑹

haze指的是米曲霉菌絲在蒸米表面擴散時呈現的白點，在釀酒師進行米曲目檢時被作為一個結果指標。在早期的hazekomi可視化研究中，Yoshii等人發表了一篇基于掃描電子顯微鏡（SEM）觀察的報告，他們通過將米曲霉傳播過程直接可視化的方式成功觀察到了米曲中米曲霉的生長，該結果有助于改善制曲過程（7）。

利用SEM將hazekomi過程可視化時，觀察微觀區域的能力是一個重要特征。不過，我們認為將整個米曲hazekomi過程可視化的方法以及可獲取成分分布信息的技術也是有用的。為了解決這一問題，我們引入了采用β-葡萄糖醛酸酶（GUS）作為標志基因的GUS報告系統用于hazekomi可視化。具體來說，通過構建米曲霉GUS表達株以及生產使用該菌株的米曲（以下稱為GUS米曲）來實現對制曲過程中米曲霉生長的清晰觀察。GUS米曲的使用實現了通過顏色反應來可視化米曲霉位置，而當這種技術和MSI配合使用時，可獲取關于成分分布的信息。這兩種技術的結合同時實現了整個米曲的hazekomi可視化以及成分分布的可視化研究。

在此我們將對這種旨在把GUS報告基因系統應用于米曲的創新研究進行闡述。GUS報告基因系統最初是為了將植物組織中菌絲體的可視化而開發的。在植物組織中，常見做法是將樣品浸泡在5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷（X-Gluc）溶液中，這是一種用于著色的顯色底物。擁有極硬細胞壁的植物組織即便是長期浸泡在X-Gluc溶液中，也能夠毫無問題地維持樣品觀察所需的形態。

不過，如前所述，米曲非常脆弱，且其性狀和植物組織*不同。這意味著采用現有的著色方案將極為困難。事實上，我們證實了在米曲浸泡在X-Gluc溶液中固定著色所需時間內，樣品的形態由于吸水而發生了很大的改變。為了避免這一問題，必須改變添加X-Gluc的方式。因此，我們構思了一種通過將X-Gluc溶液噴灑在GUS米曲切片上的方法來可視化分析hazekomi過程。

圖6顯示了采用這種方法得到的結果。這里制曲使用的是拋光率為70%的拋光白鶴錦稻米（白鶴酒造株式會社的酒米），并在制曲開始24h、31h以及43h后取樣。隨著制曲的進行，可以觀察到靛藍色從曲的表面滲透到內部。尤其是在43小時之后、制曲完成時，不僅在曲的表面，在內部也能檢測到濃烈的靛藍色，表明米曲霉已經到達了稻米內部。

曲的一個主要作用是在釀造（發酵）階段提供各種酶，以便形成酵母菌所需的營養。觀察到的主要酶為α-淀粉酶或葡萄糖淀粉酶，這兩者會形成作為酵母生長所需的葡萄糖。此外，也有報道表示α-淀粉酶可能是影響曲霉菌絲體侵入性生長的非常重要的酶。

圖6 GUS米曲中hazekomi過程的可視化分析（比例尺：1 mm（插入圖片：200 μm））

盡管既往研究中報道了制曲后葡萄糖的增加，但hazekomi和葡萄糖分布之間的關系尚未明確。在制曲過程每個階段的米曲質譜圖中，確實觀察到了葡萄糖峰強度的升高（圖7）。已有報道表明NEDC可以增加癌組織中葡萄糖檢測的靈敏度（8）。因此，當使用NEDC作為葡萄糖MSI的基質時，[M+Cl]-= m/z 215.02在負離子模式下被檢測到。

為了研究GUS米曲的hazekomi過程和葡萄糖分布之間的關系，使用GUS染色切片相鄰的切片進行了MSI，比較獲得的葡萄糖離子強度和GUS染色圖像的分布，圖8顯示其結果。

觀察葡萄糖分布及與GUS染色圖像的疊加可以了解到從制曲初始階段到后期階段，葡萄糖從外到內增加。這一結果表明hazekomi和葡萄糖分布之間存在相關性。

另外，有些區域由于X-Gluc為深色且葡萄糖強度很高而成像為藍色（黑色箭頭顯示），同時在本實驗中也能看到有些部分雖然也觀察到了hazekomi，但葡萄糖強度低，例如以黑色圓圈表示的區域。這些結果表明位置不同，hazekomi產生的葡萄糖量存在差異性。今后，可以通過包含各種代謝物（例如氨基酸、糖類、糖醇）分析的探討來實現從化學角度更好地了解hazekomi現象。

雖然目前的考察著重于葡萄糖并解釋了伴隨hazekomi過程葡萄糖分布的變化，但可以想象，形成的酶的擴散范圍和活性也會受到諸如米粒特征等其他因素的影響。這種新的可視化技術（GUS米曲和MSI的融合）預期可以改進米曲和其他曲衍生產品的制曲流程。

圖7 利用NEDC基質獲得的葡萄糖峰的時間依賴性變化

圖8 GUS米曲中葡萄糖（[M + Cl]–）的可視化（比例尺：1 mm）

結論

在本研究中，分析了磷脂在山田錦大米（清酒釀造米）中的空間分布，并利用白鶴錦米（白鶴酒造株式會社的專有清酒米）可視化分析hazekomi過程和葡萄糖分布之間的關系。同時還利用白鶴錦米制備了一種表達GUS的米曲品系，并用于揭示hazekomi過程和葡萄糖分布之間的關系。這種新的可視化技術利用了GUS米曲和MSI相結合，可有助于更好地了解米曲和其他曲衍生產品的制曲流程并改進制曲方法。由于本實驗中采用的島津iMScope成像質譜顯微鏡能同時實現微觀區域的光學顯微鏡觀察以及顯微鏡下的質譜分析，將iMScope應用于各種酒曲和其他麥芽的分析，可以獲得發酵領域相關新科學知識。

iMScope QT（圖9）是iMScope的新一代產品，于2020年6月發布。在延續iMScope TRIO的顯微鏡觀察功能和空間分辨率的同時，新的iMScope QT提供了更高的質量分辨率、檢測靈敏度和分析速度，讓分析變得更輕松。同時，由于能夠分析更寬的質量范圍，期待MSI技術可以進一步擴展在不同研究領域應用的可能性。

圖 9 iMScope QT

<參考文獻>

(1) K. Miyoshi, Y. Enomoto, E. Fukusaki, and S. Shimma, Shimadzu Application Note (No. 57).

(2) S. Shimma and T. Sagawa, Shimadzu Application Note (No. 63).

(3) S. Shimma, Y. Takashima, J. Hashimoto, K. Yonemori, K. Tamura, and A. Hamada, J. Mass Spectrom., 2013, 48, 1285

(4) N. Zaima, N. Goto-Inoue, T. Hayasaka, and M. Setou, Rapid Commun.Mass Spectrom., 2010, 24, 2723.

(5) A.P.Wisman, Y. Tamada, S. Hirohata, K. Gomi, E. Fukusaki, S. Shimma, J. Biosci.Bioeng., 2020, 129, 296

(6) A.P.Wisman, Y. Tamada, S. Hirohata, K. Gomi, E. Fukusaki, and S. Shimma, J. of Brew.Soc.Japan (in press).

(7) M. Yoshii and I. Aramaki, J. of Brew.Soc.Japan, 2001, 96, 806.

(8) J. Wang et al., Anal.Chem., 2015, 87, 422.

文獻題目

《成像質譜顯微鏡用于米曲中磷脂和葡萄糖的可視化分析》

使用儀器

島津iMScope TRIO

作者

Shuichi Shimma *1, 2, Yoshihiro Tamada *3, Adinda Putri Wisman *1, Shuji Hirohata *3, Katsuya Gomi *4 Eiichiro Fukusaki *1,2

*1 大阪大學工程研究生院生物技術系

*2 大阪大學島津組學創新研究室

*3 白鶴酒造株式會社

*4 日本東北大學農學研究生院未來生物產業的生物科學與生物技術系