發光細菌法(Microtox)是環境樣品毒性檢測的生物測試技術，并已被列入德國國家標準(DIN38412)和標準(ISO11348)。毒性是一項綜合的生物學參數，它是衡量樣品對活性生物體所產生的影響，不能以化學分析的方法進行測定，而其他的生物測試方法如魚類試驗、浮游動物試驗、藻類試驗等則較為復雜，且必須使用高等生物進行試驗，從而引起眾多的爭議。發光細菌測試使用了具有發光特性的天然微生物，而毒性物質則將抑制起發光，且毒性越強光抑制越明顯，這一方法經研究被證實具有快速、簡便的特點，同時有很好的靈敏度和可靠性。另外，發光細菌本身沒有危害性。

發光細菌毒性檢測的整個過程在60分鐘之內，發光抑制率通過測定起始和終止狀態時的細菌發光值并計算得到，測試的結果有如下兩種：

l光抑制率，通過計算直接測定樣品的毒性

l稀釋因子GL，在DIN的分析中，將樣品稀釋成系列濃度并測定每個稀釋濃度的抑制率，其中造成20%或20%以下抑制率的樣品稀釋度即為GL

德國政府的相關法規及應用

化學工業的廢水、填埋場滲出液和工業冷卻水必須通過發光細菌的毒性測試。同時，德國聯邦環境部門正在起草制定合適的指導性技術，從而對其他的工業部門進行監督。發光細菌試驗是取代魚類毒性試驗的方法之一，并且已在Bavarian地區進行了試點。

德國水管理法(WHG)規定對填埋廠滲出液和工業冷卻水進行發光細菌毒性測試，這些廢水的毒性將造成嚴重的問題，如生物污水處理系統和地表水的破壞，因此，WHG明確規定了廢水排放的毒性限制：

l填埋場滲出液經常具有較嚴重的污染，GL=4

l工業冷卻水的污染部分是由于生物殺滅劑，GL=12

l現在起，化學工業的廢水也被規定進行發光細菌毒性測定，GL=32

廢水監測的目標是含蓋90%以上的部門，包括醫院廢水（其中被發現存在毒素），大量使用清潔劑和表面活性劑的部門（如食品和飲料業），石油工業等。根據WHG的規定，必須對20個以上的部門所排放的廢水以魚類試驗進行毒性監測，Bavaria地區于1993年起采用了發光細菌和Daphania的試驗代替魚類試驗，該模式現在已被全德國所接受，其結果等同于魚類試驗。在魚類試驗、浮游動物試驗、藻類試驗和發光細菌的毒性測試比較中，發光細菌法為敏感，被測出毒性的廢水比例高。

表1. 不同工業部門發光細菌毒性檢測的規定（德國聯邦環境辦公室，1998）

GX: 稀釋因子，樣品不產生毒性效應的

GF: 魚類試驗，GD: daphania試驗，GA: 藻類試驗，GL: 發光細菌試驗

歐盟和美國的相關政府指導性文件：

歐盟關于邊界河流水質控制的指導性文件：

由于毒性物質排放所造成的污染，所以需通過生物試驗對環境水樣、沉積物、流出物進行毒性測定，從而為環境和生態系統的安全提供早期的預警。環境樣品毒性測定所選用的方法所要考慮的因素包括：方法的靈敏度、快速性，方法要能覆蓋較廣范圍的化學毒性物質。其所列出的排放物、環境水、沉積物的毒性測試方法包括發光細菌法(Microtox)、浮游生物(D.magna)、藻類、魚類試驗等，其中Microtox方法的特點是反應快速、操作簡便。

美國環保局(EPA)全廢水毒性試驗：污染物測定程序的指導性文件：

EPA對于排放物的控制的經典方法是實行對特定化學物質的指標限制，但是在實際的環境樣品中人仍存在很多未知的化合物，另外，化合物的毒性效應是所有組成物質拮抗作用或抑制作用的綜合結果，所以單純的化學物質的限定不能為水體的安全提供充分的保障。在此情況下，EPA和各州的環保局正開始使用生物學的方法對排放物的毒性進行測定（而不是傳統的毒物的化學分析），從而終判定環境樣品的綜合毒性效應。EPA在1994年所頒布的“全廢水毒性控制方案”即指出采用毒性指標來控制通過NPDES程序的污染物的排放。方案指出，流出物的生物毒性檢測是水質控制的重要方面。關于生物試驗的方法，目前有魚類試驗、浮游動物試驗等，雖然Microtox試驗尚未列入正式的測試方法，但EPA已經指出該方法可以作為一項毒性篩選試驗，并且承認其是一種有效的毒性檢測的工具。

使用發光細菌進行毒性檢測的原因：

發光作用是發光細菌正常生理狀態下所具有的性質，它是細胞呼吸作用的副產物，而呼吸作用則是細胞和生物代謝的基本過程，細菌的發光直接和其呼吸相關，當細胞活性受到毒性物質作用后，其活性將受到抑制，從而使呼吸速率下降，進而導致發光降低，樣品的毒性越強，發光細菌的光損失越多，以細菌發光法測定樣品的毒性已經被證明是一種方便、可靠的生物傳感方法。

Microtox急性毒性檢測系統概述：

該系統使用凍干的發光細菌制劑，通過15分鐘的暴露試驗，測定其代謝的抑制情況，從而計算出樣品（水樣、土壤樣品）的毒性。該方法以通過工業、研究和政府的試驗被證實有效，至今，已有超過500的關于Microtox系統應用和評價的論文。同時該測試方法已在多個國家被認可為*標準，包括ASTM(D-5660)。ISO11348-3（水質測定—水樣對于發光細菌的抑制效應測定）的草案也已經得到批準。加拿大已經批準該方法為常規的測試應用于石油鉆井中的排水監測。另外，這一方法已被提交美國環保局作為全廢水毒性測定(WET)的測試，從而作為國家污染和排放物減除系統(NPDES)中一項新方法。

Microtox試驗的靈敏度：

目前，公開的數據庫中已經保存了1200種以上化學物質的Microtox測試的EC50值。

Microtox試驗的準確性：

Microtox試驗已經進行了充分的重復性試驗，包括實驗室間的比較，證實其變異系數在20%以內，與化學分析方法類似，明顯優于其他生物學測試。

Microtox試驗的應用：

該方法已廣泛、成功地應用于環境和過程的監測，具體包括：

l污水處理場的流入液的檢測，以保護活性污泥的生物活性；

l污水處理廠的流出液的檢測，以保護受納水體的安全；

l毒性減低評價(TRE’s)和毒性鑒定評價(TIE’s)；

l表層水的監測以確定點源污染和非點源污染；

l生飲水的檢測；

l沉淀物的測定；

l土壤污染的檢測及其恢復過程的監測；

l工業過程中水體中生物殺滅劑的檢測

關于使用Microtox試驗進行飲用水監測的情況：

使用Microtox試驗監測飲用水的原因：

   Microtox試驗是建立在生物傳感器基礎上的毒性檢測系統，它能有效地檢測突發性或破壞性的水源污染，已有多個國家將該系統應用于飲用水的監測。在美國，城市中偶發的和蓄意性的污染特別引起關注，本方法可以在15分鐘內快速地完成檢測，從而對水質的變化作出迅速的反應，另外，Microtox試驗快速篩選結果的可靠性及其操作的簡便性、成本的合理性也使之成為重要點源上水質的常規監測的有效手段。

Microtox試驗對特定情況下的飲用水的檢測：

美國*的供水系統和華盛頓地區的供水管道都使用該檢測方法對飲用水進行監測，從而保護平民和軍事人員免受引水污染的危害。

1984年洛山磯和1996年亞特蘭大奧運會期間、1991年海灣戰爭以及2000年民主黨全國代表大會期間都采用了該方法對飲用水的處理和分配系統進行連續的監測，以保證飲水的安全。

Microtox試驗的檢測范圍：

經過近20年的科學研究，已經證明該方法對數千中不同類型的化學物質具有敏感的效應，其反應的毒性物質包括重金屬、農藥、真菌殺滅劑、殺鼠劑、有機溶劑、工業化合物等。

下表列出了部分毒性物質及其Microtox試驗的檢測限

不使用直接化學分析的原因：

   對于綜合性樣品的處理研究表明，特異性化學分析測定未知樣品的毒性僅占毒性檢測的20%，化學分析雖然靈敏、準確，但由于時間、費用以及對樣品的不可知性使其在毒性的實際篩選中受到很大限制，另外，混合樣品中不同的化合物彼此之間存在著協同或拮抗作用，所以終的毒性作用并非單一物質作用的加減，因此必須使用生物方法對綜合的毒性效應（尤其對于未知物）進行測定。目前所應用的生物檢測主要包括：魚類試驗、藻類試驗、D.magna試驗和Microtox試驗，前三種試驗周期長、操作復雜，而Microtox試驗解決了上述問題，并且數據的準確性和重復性也明顯提高。

測試儀器的簡便性：

   Microtox試驗所使用的儀器小巧，便于攜帶，可用于實驗室研究和分析，同時也可在現場或野外進行原位即時的監測。

發光細菌毒性檢測的原理：

發光細菌體內的熒光素酶催化熒光素的氧化作用，反應如下：

FMNH2+O2+R-CO-H→FMN+R-COOH+H2O+Light

從而產生生物發光，它直接與細胞的活性及代謝狀況相關。毒性物質將改變細胞的狀態，包括細胞壁、細胞膜、電子的轉移系統、酶及細胞質的結構，這些變化終將導致生物發光的減弱。通過生物發光光強的測定即可計算得到樣品毒性的強弱。

Modern Water公司microtox檢測系統

使用活體生物的檢測技術是測定水樣和土壤樣品所存在和潛在毒性的*可靠的方法，Modern Water經過多年的發展與改進，在生物毒性試驗和儀器準確性結合的基礎上發展了生物毒性檢測系統，使Microtox檢測系統變得更加便攜，。

發光細菌毒性檢測近期研究論文：

Microtox試驗作為一種新的有效的醫療儀器和器材的安全檢測方法。

J Biomater Appl 1998 Oct; 13(2): 166-171

城市地下水質量快速生物檢測方法的比較，生物檢測能準確、有效地測定環境對地下水的毒性影響，而Microtox試驗較之D. magna試驗具有更好的重復性。

Chemosphere 2002 May; 47(5): 547-54

廢水毒性的評價：Microtox試驗和活性污泥氧吸收抑制試驗的比較，Microtox試驗具有很高的靈敏度，是測定污水處理廠廢水毒性的有效工具。

Water Res 2002 Feb;36(4): 919-24

應用Microtox試驗檢測Albufera國家公園的水質毒性

Chemosphere 2002 Jan;46(2): 355-69

檢測藥物在水中的毒性，首先使用Microtox試驗對不同的藥劑進行毒性試驗

J Chromatogr A 2001 Dec 14;938(1-2):187-97

三種商品化生物發光毒性檢測系統對化學毒性的測定

Water Res 2001 Oct;35(14):3448-56

運用生物發光毒性檢測技術對石油污染的土壤進行生態危害評價

Environ Toxicol Chem 2001 Jul;20(7):1438-49

金屬工廠廢水毒性測定方法的比較，Microtox試驗和魚類試驗

兩者具有很好的相關性，而Microtox試驗更適合于工業廢水的監測

Environ Toxicol 2001;16(2)136-41

Microtox試驗對于有機磷殺蟲劑及其代謝產物毒性的研究

Aq. Tox. 1994: 30(3):259-270

發光細菌毒性檢測研究報告：

   美國能源部Los Alamos實驗室(LANL)使用Microtox試驗對特殊的含放射性物質的污水排放物進行原位的快速監測，結果也證明了該方法的靈敏、快速以及分析成本較低、操作簡便。

   法國環境科學中心毒理實驗室對Microtox試驗和D.magna試驗進行了比較，對39種化合物的實驗結果顯示兩者的一致率達86%，而Microtox試驗更為方便，更適合對工業排放物進行毒性篩選。

   瑞士實驗室的研究結果表明，Microtox試驗能夠很好地測定土壤中殘留的農藥及其主要代謝產物的毒性。

   科威特地球環境科學研究部門的環境科學實驗室使用Microtox試驗對排放入Shuaiba灣的工業廢水對海水所造成的毒性進行研究，發現部分樣品產生中等的毒性效應，并有季節性的變化。

   荷蘭阿姆斯特丹的Omegam環境研究所運用Microtox試驗等的毒性實驗方法對阿姆斯特丹地區9個淡水系統的沉積物的孔隙水(pore water)進行毒性檢測研究，其中3個根據荷蘭污染控制法的規定要求存在較嚴重的污染。

   香港科技大學生物研究中心運用Microtox試驗對維多利亞港的海水沉積物進行分析發現其中部分樣品存在重金屬污染所造成的毒性。

   意大利米蘭的水研究所使用Microtox試驗對意北部的Orta湖的沉積物進行了毒性研究，發現人造纖維工廠附近的區域由于銅和氨的排放，孔隙水中有較明顯的毒性。

   密歇根大學的研究人員應用Microtox試驗、D.megna試驗和Chironomus tentans試驗對底特律河的沉積物的毒性進行研究，結果顯示Microtox試驗的時間短也為敏感。

   巴爾第摩水與廢水局面對隨時可能的毒性物質的超標排放，開始執行排放物的毒性控制以保證水質，毒性排放監測的方法中即包括了Microtox試驗。

   西班牙農業部門的研究發現，環境水體中包含了很多未知的組成物質，其效應是多種因素的綜合作用，因此其對環境的危害性影響的判別很復雜，而Microtox試驗是對混合樣品的毒性進行評價的很好工具。

   荷蘭的公共健康和環境保護實驗室運用Microtox試驗對萊茵河的河水進行實時監測，由于試驗只需15分鐘，因此如發現毒性問題，可立即采取措施，是河水在進入荷蘭后其毒性物質和作用逐步降低。

   美國環保局的一項研究報告指出，暴風雨引起的污水存在一定的毒性，使用Microtox試驗對其進行的研究表明，9%的暴風雨污水(stormwater)經分析具有顯著的毒性效應。

   以色列的研究人員的研究結果認為Microtox試驗由于其經濟性和管理操作的可行性，因此是工業園區污染源監控處理的一種有效工具。

   美國的研究發現家禽養殖場除了營養物質以外還包含了許多毒性化學物質，通過發光細菌的毒性試驗可以快速地發現養殖場排放和滲出液中所存在的毒性。

   美國海洋資源部門對船塢滲出液的研究發現木材防腐劑存在著毒性作用(Microtox試驗)，從而對河口水環境造成污染。

   在水質監測分析方面，發光細菌法(Microtox)以其快速篩選，結果的可靠性及其操作的簡便性、成本的合理性等優點，必將為水質的監測，帶來便利以及更美好的前景。

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