PEI轉染手冊

轉染操作流程：
 
  1、細胞傳代：

轉染前24h內分離293T細胞至含10％胎牛血清的DMEM培養基 中進行傳代培養，接種密度如下：
         6孔板：0.5x10⁶細胞
         10cm培養皿：4.0x106細胞
         15cm培養皿：9.0x106細胞

2、轉染

轉染前將所有試劑置于室溫。

2.1質粒DNA的稀釋

在無菌試管中，用無血清的DMEM W / O酚紅培養基（濃度為10％）稀釋質粒DNA（ug）。病毒包裝體（psPAX2）：病毒包膜（pMD2G）和重組質粒DNA的稀釋比例分別為4:2:1。
       

6孔板：200ul+3ug的DNA
        10cm培養皿：1ml+7-8ug的DNA
        15cm培養皿：2ml+11-12ug的DNA

   2.2 轉染復合體形成

將PEI（1ug/uL）加入已稀釋的總DNA中，PEI與DNA（ug）的混合比率為3:1。加入后立即渦旋混合。
      

 6孔板：9ul PEI復合體（1ug/ul）=9ug
        10cm培養皿：21ul PEI復合體（1ug/ul）=21ug
        15cm培養皿：33ul PEI復合體（1ug/ul）=33ug
將添加到細胞的DNA/ PEI的混合物在室溫下孵育15分鐘。

4、收獲轉染細胞

轉染后48小時內收獲轉染細胞/或病毒上清。
 
試劑的配制：
PEI（1ug/ul） Polysciences（CAT＃23966-2配制成儲液：)
1、將無內毒素的無菌水加熱至80℃左右溶解PEI，冷卻到室溫。
2、調整pH值至7.0，用0.22um的濾器過濾消毒，分裝后儲存在-20℃。工作液可保持在4℃

訂貨信息

友情提醒：
Polyethylenimine, Linear (MW 25,000) 23966-2為Polysciences公司生產的化合物產品，每批產品出廠前都經過嚴格的檢測,保證每批產品都*、穩定且高品質,但由于作為轉染試劑使用過程中有很多實驗室因素(PH,水純度,稱量的準度,dna純度…)造成溶解出現問題或者轉染效率出現差異,所以廠家只受理該產品純度，分子量及重量缺失破損等相關投訴，針對極個別客戶溶解問題和轉染效率問題我們只能友善解決,所以不能保證您能獲得滿意答復，對于產品應用方法的問題，不作為評價我們售后工作的依據。
如果我們提供的PEI手冊都無法解答您的問題,建議您可以多看文獻,多調整一下轉染條件,找出適合自己細胞的轉染方法。如果無暇摸索條件,您也可以直接購買我們EZ Trans細胞轉染液,這樣免去您很多煩惱,謝謝理解

改進的PEI轉染試劑EZ Trans細胞轉染液 96孔細胞培養板用量  現實中濃度請調整，MAX請適當調整濃度

改進的PEI轉染試劑Sinofection和其他產品的對比

Transfection with Sinofection has been proved to provide higher levels of protein expression in several cell lines than leading competitor’s products. For large-scale production of recombinant proteins, Sinofection is the best choice to achieve the optimum yield. In addition, Sinofection also exhibits high transfection efficiency to ensure successful transfections.

Fig. 1 Protein expression levels by transient transfection using Sinofection and other competitors were compared in 9 cell lines, 6 of which showed superior results transfected by Sinofection （A~F）. Protein expression level was determined by Elisa assay. The transfection by competitor transfection reagents followed the manufacturers’ protocols.

Excellent transfection of both adherent and suspension cells for a broad range of cell lines

Hundreds of recombinant antibodies and proteins have been successfully expressed by transient or stable transfection with Sinofection at various scales, from 0.1ml in a 96-well plate to 50L in a bioreactor. Utilizing EZ Trans細胞轉染液 for all scales of transfection application will save the cost of research and production to a great extent.

Striking stability at 37°C

Long-term stability test showed Sinofection remained its activity at 37°C for at least 4 months. Storage at -20°C~RT can maintain stable for at least 6 months. Exceptional stability resulted from rigorous screening and reliable investigation for a long time. Thus the stability of Sinofection can outperform any other transfection reagent.

Fig. 2. Stability test for Sinofection at 4 temperatures during 26 weeks. One recombinant antibody and recombinant VEGF-Fc were tested for expression level by transient transfection with Sinofection stored under different conditions. Expression level was assayed by Elisa.

Easy and fast procedure

Transfection protocol （35-mm dish）:

Preparation of cells

• Adherent cells
  • One day before transfection, plate 0.2–2×106 cells in medium per 35-mm dish. Incubate at 37°C （5% CO2） overnight. The confluency of cells should be 50–80% before transfection.
• Suspension cells
  • Plate 2 ml freshly passaged cells at a density of 5 × 104/ml to 1 × 106/ml in a 35-mm dish. The suspension cells should be in log growth phase at the time of transfection. Incubate cells at 37°C （5% CO2） overnight. The cell number depends on your needs and the cell type to be transfected.

Preparation of EZ Trans細胞轉染液&DNA complexes

Dilute DNA with appropriate diluents, such as PBS, NaCl solution, glucose solution, DMEM, medium with or without serum, whichever is isotonic, to a concentration of 20 μg/ml （optimization recommended） and a total volume of 250 μl.

Dilute EZ Trans細胞轉染液 of appropriate amount in 250 μl of medium.

Combine the diluted DNA with the diluted Sinofection （total volume = 500 μl）. Mix gently and incubate for 20 minutes at room temperature （solution may appear cloudy）.

Transfection

Add the 500 μl complexes drop-wise to cells and medium. Gently rock the dishes or wells to ensure even distribution.

Incubate cells at 37°C in a CO2 incubator for 18-48 hours （normally high expression is achieved after 72 hours） prior to protein expression assay.

Transfection protocol （flask）:

Transfecting Cells for Protein ExpressionThis protocol is typically used to transfect DNA into 293 EBNA or CHO cells cultured in flasks. Use sterile DNA or filter-sterilize DNA before use （re-quantify your DNA after filtration）.

All amounts are on a per flask basis for 30 ml cultures in a 125 ml shake flask; for other formats, see Table 2. Scaling up or Down Transfections.

Table 2. Scaling up or down transfections with Sinofection. Note: the actual conditions should be optimized by experiments.

1. Pass 293 cells at 0.3 × 105 cells/ml, shake at 175 rpm. After 72 hours, dilute cells to 1.0× 106 cells/ml, shake at 175 rpm. Transfect after 4 hours.
2. Pass CHO cells at 0.3 × 105 cells/ml, shake at 175 rpm. After 48 hours, dilute cells to 1.0× 106 cells/ml, shake at 175 rpm. Transfect after 4 hours.
3. Dilute the required plasmid DNA amount with appropriate diluent, such as PBS with Mg2+, 150mM NaCl, 300mM glucose, DMEM medium with or without serum, whichever is isotonic. Incubate for 5 min at room temperature. Add the required Sinofection volume to the diluted DNA and mix gently to assure a total volume of 1.5~3ml.
4. Incubate the mixture for 10-20 minutes at room temperature to allow complexes to form. Do not incubate for longer than 20 minutes.
5. Slowly add 1.5~3ml of DNA-lipid mixture into the 125ml flask containing cells while slowly swirling the flask.
6. Incubate transfected cell cultures at 37°C, 8% CO2 on an orbital shaker set to 175 rpm for both 293 cells and CHO cells.

Low cytotoxicity

EZ Trans細胞轉染液 demonstrates very low cytotoxicity which is tested and verified by in-house WST-8 assay for each lot. The WST-8 assay is based on the colorimetric reduction of water soluble tetrazolium （WST） by mitochondrial dehydrogenase

The absorbance of formazan dye solution is in direct proportion to the number of viable cells. Compared with the prev alent WST-1 method, the sensitivity of WST-8 assay is higher meanwhile the solubility and stability of formazan dye is better.

Fig. 3. Microscopy comparison of HeLa cells and DG44 cells transfected with L2K and Sinofection respectively. Transfections were performed following the manufacturer’s recommendations.

Fig. 4. Cytotoxicity comparison of Sinofection and L2K for 4 cell lines. Transfections were performed following the manufacturer’s recommendations.

 常規轉染技術可分為兩大類，一類是瞬時轉染，一類是穩定轉染（*轉染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個宿主細胞中可存在多個拷貝數，產生高水平的表達，但通常只持續幾天，多用于啟動子和其它調控元件的分析。一般來說，超螺旋質粒DNA轉染效率較高，在轉染后24-72小時內（依賴于各種不同的構建）分析結果，常常用到一些報告系統如熒光蛋白，β半乳糖苷酶等來幫助檢測。

穩定轉染，外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在。盡管線性DNA比超螺旋DNA轉入量低但整合率高。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/104轉染細胞能整合，通常需要通過一些選擇性標記，如來氨丙基轉移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸轉移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反復篩選，得到穩定轉染的同源細胞系。轉染技術的選擇對轉染結果影響也很大，許多轉染方法需要優化DNA與轉染試劑比例，細胞數量，培養及檢測時間等。

EZ Trans細胞轉染試劑是一種陽離子聚合物（PEI）細胞轉染液，是新一代的轉染試劑，帶正電的聚合物與核酸帶負電的磷酸基團形成帶正電的復合物后與細胞表面帶負電的蛋白多糖相互作用，并通過胞吞作用進入細胞。除了具有陽離子脂質體（如：Lipo2000,3000）的轉染效率高，操作簡單，適用范圍廣，重復性好等特點外，還具有在體內，轉染效率高，細胞毒性低等特點。

EZ Trans細胞轉染試劑一種具有較高的陽離子電荷密度的有機大分子，每相隔二個碳個原子都是質子化的氨基氮原子，使得聚合物網絡在任何pH下都能充當有效的“質子海綿”體。其轉染性能好于樹枝狀聚合物，而且它的細胞毒性低.

EZ Trans細胞轉染試劑與其衍生物用作基因轉染載體的研究比分枝狀PEI（也寫作：BPEI, 24765-2）要早一些，過去的研究認為在不考慮具體條件情況下，LPEI/DNA轉染復合物的細胞毒性較低，有利于細胞定位，轉染效率比BPEI高一些。但zui近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的轉染復合物,從而提高轉染效率。本公司兩種PEI轉染液均可提供，您可根據文獻選擇使用。

幾種細胞轉染方法（試劑）特點比較表

運輸與保存方法

常溫運輸，4℃保存，保質期12個月。

使用注意事項:

質粒質量：請務必使用高質量轉染級無內毒素質粒（推薦使用QIAGEN或者MN公司去內毒素質粒提取試劑盒）。通過 260 nm 光吸收測定 DNA 濃度，260 nm / 280 nm 比值確定 DNA 純度（比值應該在 1.8~2.0 的范圍之內）。如有可能，請通過瓊脂糖凝膠電泳檢測質粒的完整性。

細胞條件：使用適當保存和經常傳代的健康細胞。確保培養基沒有被細菌、真菌或支原體污染。如果細胞是近期復蘇的液氮凍存細胞，請在轉染前至少傳代兩次。建議使用GIBCO或者78bio公司血清培養細胞。?

使用方法：

瞬時轉染方法

1. 接種細胞：轉染前一天，用膠原酶消化細胞并計數（不建議用胰酶）。調整細胞濃度，將細胞鋪入細胞培養的器皿，每個孔置入的細胞量應能使轉染時細胞匯合度達到 70~80%。

2. 準備 DNA-PEI 復合物： DNA、PEI 試劑和稀釋劑在進行以下步驟前需先使其升至室溫。依據下表所示，用 Opti-MEM ITM（Invitrogen）或其他適合的無蛋白培養基稀釋適量 DNA。用同樣的培養基稀釋PEI 試劑。每 1 μg DNA 需用2-5 μL 線性PEI轉染試劑。一邊輕輕渦旋裝有 DNA 溶液的試管，一邊將稀釋的線性PEI轉染試劑滴加至試管中（注意：請勿顛倒添加順序）。充分混勻后，室溫靜置 10~25 min 以形成DNA-PEI復合物。當溶液體積較大時，請用圓底聚丙烯管，例如 Falcon 5 mL /14 mL 離心管。

3. 轉染細胞：直接向每個孔中加入 DNA-PEI復合物并輕輕渦旋培養板/培養皿。在無血清條件下轉染時，去除生長培養基，替換成無血清培養基，然后滴DNA-PEI復合物。轉染 3 h 后，添加1/2體積的包含 30%血清的生長培養基。

4. 孵育細胞和分析結果：在 CO2培養箱中 37℃下孵育細胞至可以分析檢測。轉染后zui快 7h 即可檢測到轉入基因的表達。請自行確定檢測時間。?

穩定轉染方法

1. 接種細胞：轉染前一天，用胰酶消化細胞并計數。調整細胞濃度，將細胞鋪入細胞培養的器皿，總體積如表 1 所示，每個孔置入的細胞量應能使轉染時細胞匯合度達到 70~80%。

2. 準備 DNA-PEI 復合物： DNA、PEI 試劑和稀釋劑在進行以下步驟前需先使其升至室溫。依據表 1 所示，用 Opti-MEM ITM（Invitrogen）或其他適合的無蛋白培養基稀釋適量 DNA。用同樣的培養基稀釋PEI 試劑。每 1 μg DNA 需用2-5 μL 線性PEI轉染試劑。一邊輕輕渦旋裝有 DNA 溶液的試管，一邊將稀釋的線性PEI轉染試劑滴加至試管中（注意：請勿顛倒添加順序）。充分混勻后，室溫靜置 10~25 min 以形成 DNA-PEI復合物。當溶液體積較大時，請用圓底聚丙烯管，例如 Falcon 5 mL /14 mL 離心管。

3. 轉染細胞：直接向每個孔中加入 DNA-PEI復合物并輕輕渦旋培養板/培養皿。在無血清條件下轉染時，去除生長培養基，替換成無血清培養基，然后滴DNA-PEI復合物。轉染 3 h 后，添加½體積的包含 30%血清的生長培養基。

4. 孵育細胞和分析結果：在 CO2培養箱中 37℃下孵育細胞至可以分析檢測。轉染后zui快 7h 即可檢測到轉入基因的表達。

5.轉染 24 h 后，將細胞傳代至新鮮的生長培養基中（將細胞稀釋 10 倍以上），在 CO2培養箱中 37℃孵育12小時。第二天加入與轉染抗性基因相匹配的篩選藥物。約 1~2 周可篩選到耐藥性克隆，在這期間需經常更換含篩選藥物的生長培養基。?

特別提醒:

1. 對于某些類型的細胞如 HEK-293、HEK293T、NIH/3T3 和 COS 細胞，在轉染前兩天鋪板可顯著提高轉入基因的表達水平。如果選擇轉染前兩天鋪板，可適當降低鋪板密度，以確保轉染時細胞的匯合度仍為 70~80%。

2. 對于接觸抑制敏感的細胞，可適當降低鋪板密度。

3. 即使在有蛋白（如 10%的血清）存在的情況下，DNA-PEI復合物仍能轉染細胞，但是 DNA-PEI復合物必須在無蛋白存在的條件下形成。我們推薦使用 Opti-MEM ITM 培養基以達到*轉染效率。其他的無蛋白培養基則需測試與線性PEI轉染試劑的兼容性。

4. 對大多數細胞來而言，每 1 μg DNA 使用 3.0 μLEndoFectinTM 試劑都能獲得較高轉染效率。使用者也可嘗試每 1 μg DNA 使用 1~4 μL 體積線性PEI轉染試劑進行優化。