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一、介紹

         軟骨在面部特征的形式和功能方面起著關鍵作用。當鼻子或耳朵的軟骨因損傷而受損時，它沒有再生的能力。這意味著一旦耳朵或鼻子的軟骨結構被破壞，耳朵或鼻子就會殘缺不全。然后，需要一個重建程序來創建一個具有能夠承受正常機械力的良好3D結構的新框架。實際上，鼻竇或輕微耳缺損的重建常使用耳廓或鼻室間隔軟骨移植物進行。1，2在更廣泛的情況下，可以使用肋軟骨，為收獲提供更多的材料并提供更剛性的支撐。耳、室間隔或肋軟骨可用于重建，但移植材料的可用性通常有限，供體部位的發病率仍然是一個風險。燒傷患者尤其如此，由于突出的位置和薄薄的皮膚覆蓋，他們經常遭受鼻子和耳朵的廣泛損傷。1，3，4因此，再生醫學為克服這些問題提供了令人興奮的可能性。組織工程領域的新發展已經進入臨床。例如，Yanaga等人進行了幾項臨床實驗，其中從耳朵分離的自體軟骨細胞中新開發的軟骨用于耳朵框架重建。2，5隨著對組織工程替代品的日益關注，我們需要有關我們正在尋求復制的組織的結構信息。然而，文獻中關于各種面部軟骨類型（特別是耳，鼻翼和鼻間隔軟骨）之間的機械特性以及組成和結構差異的數據很少。

    雖然它們具有共同的胚胎起源，但面部軟骨很快就會根據其特定的結構功能分化成不同的軟骨亞型。在脊椎動物發育的早期階段，將成為頭部和頸部的胚胎區域被短暫地劃分為稱為咽?。≒A）的片段。耳朵具有組合的起源，來自PA1和PA2，它們在6周發育時形成他的小山丘。最終，這6個小山丘融合在一起形成外耳。6，7PA1進一步向外生長，形成下頜骨突和上頜骨突。后者后來形成額葉突出以及內側和外側鼻突，其將形成鼻翼，并在最終融合到鼻中隔后形成。8

    成熟的耳軟骨由彈性蛋白纖維和膠原束的復雜網絡組成，這些膠原束被一層周旋物包圍。這種高彈性蛋白含量使其在面部區域的各種軟骨亞型中。另一方面，人類鼻子的解剖結構由幾個獨立的結構元素組成。主要部分是鼻中隔，為鼻梁以及鼻外側和小葉軟骨的兩側提供支撐，以支持鼻竇。該側區域還包括幾個芝麻軟骨和附屬軟骨。與耳軟骨相比，鼻部結構全部由透明軟骨組成。透明軟骨主要由膠原蛋白組成，特別是II型，分為幾個區域。9

    細胞外基質（ECM）結構及其生化組成對軟骨的機械功能至關重要。標準生化測定可用于測定主要組織組分的濃度。為了可視化ECM的3D結構，多光子激光掃描顯微鏡已被用于其他組織，如關節軟骨。10該方法能夠揭示必需的基質成分，即軟骨細胞，膠原蛋白和彈性蛋白纖維，無標記，具有亞細胞分辨率和深度滲透。11

    據報道，面部軟骨類型的僵硬差異很大。由于使用不同的技術來測量軟骨，因此很難給出一般值。除了具有不同局限性和優點的拉伸或壓痕測量外，12辨別機械測試的不同幅度或規模也很重要。對于大機械性狀的評估，對于維持大形狀很重要，特別是在手術重建中，已經描述了各種技術。13–16這同樣適用于原子力顯微鏡（AFM），其中對軟骨的表面微觀力學進行了廣泛的研究。17–19然而，在AFM和粗大機械測試之間，支架細胞環境的機械條件對細胞的行為有重要影響。20因此，它是軟骨充分再生的基礎。21因此，需要深入了解ECM水平上的局部機械性能和結構，以便為細胞分化提供合適的環境。本研究中使用的設備允許在更高深度范圍內以微米級壓痕，提供有關不同軟骨亞型的基本機械信息。

     了解組織結構的基礎知識對于充分的組織工程至關重要。從實踐中，外科醫生熟悉了重建手術中軟骨的粗機械特征。然而，機械行為基本上是通過細胞及其周圍結構的復雜共生在微觀尺度上確定的。

     在本文中，我們的目標是通過使用新技術在ECM水平上評估這些參數，在結構和機械水平上提供有關面部軟骨類型之間差異的基本信息。雖然沒有直接的實際意義，但它也可以為外科醫生提供新的見解和靈感，通過更好地了解他們所處理的組織的性質來優化他們的重建工作。隨著再生醫學的進步，外科醫生將達到一個點，這些知識將被證明是無價的。

二、方法

    （1）樣品

     根據該機構的道德準則，從10名新鮮冷凍尸體供體（8名男性，2名女性）中收集軟骨樣本，平均年齡為66.5±6年。從每個供體中，用4mm活檢打孔器從耳殼，內側鼻絲軟骨和外側鼻翼軟骨中取出2個相鄰樣本。樣品在-20°C下運往VU大學（荷蘭阿姆斯特丹）進行生物力學和微觀評估，或EMC（荷蘭鹿特丹）進行生化評估。在實驗前解凍樣品，并通過手術切除剩余的組織和周邊。

    （2）凹痕

         為了確定機械性能，使用新型商用納米壓痕儀（Piuma;Optics11，荷蘭阿姆斯特丹）。該設備采用套圈頂懸臂探頭22施加負載并使用基于光纖的讀數同時測量壓痕深度（圖1.（圖1A，1A， C）。在此設置中，使用了直徑為78 μm的球形探頭，能夠在壓痕深度為1至17 μm時施加0.1 μN至7.5 mN的力。在每個系列實驗之前，通過縮進剛性表面并將懸臂彎曲等同于探頭位移來執行懸臂彎曲校準。每個樣品在同一解剖位置上以網格模式縮進10次，測量之間的距離為100μm。由此產生的應力應變曲線（圖.（圖1B）1B）使用Oliver和Pharr推導的球形壓頭的數學模型進行分析，以確定有效的楊氏模量（E *）。23壓痕協議經過精心優化，以最大限度地減少影響測量的粘彈性效應（未顯示數據）。

圖 1.

壓痕和多光子激光顯微鏡技術概述。A，懸臂壓痕裝置的設置（Piuma，Optics11）。B、軟骨測量的壓痕曲線示例。紅色切線表示用于確定楊氏效應模量的卸載曲線的斜率。C，壓頭的圖形細節，球形成壓頭的（φ78μm）。D，光學設置多光子激光掃描顯微鏡TriMScope I（LaVision Biotech），鈦藍寶石激光器。E，SHG通道顯示膠原蛋白束。F，2PF通道顯示彈性蛋白纖維。BP，帶通濾波器;CIT，懸臂壓痕;DM，二向色鏡;GS， X-Y 振鏡掃描鏡;紅外-L， 紅外激光;紅外-PD，紅外激光二極管;L，透鏡在PMT的前部;MO，顯微鏡物鏡;OF， 光纖;聚酰胺，光電倍增管;SL，掃描鏡頭;TL，鏡筒透鏡。

   （3）生化評價

        在生化分析之前，測定所有軟骨樣品的濕重，然后在60°C下在木瓜蛋白酶溶液（0.2M Na）中消化過夜2H2采購訂單4， 0.01M 乙二胺四乙酸乙酯2O，250μg/ mL木瓜蛋白酶，5mM L-半胱氨酸，pH 6.0）。

    每個木瓜蛋白酶消化的軟骨樣本中測量的DNA量由溴化乙錠（GibcoBR1）測定，使用小牛胸腺DNA（Sigma-Aldrich）作為標準。用分光熒光計（Wallac 1420 Victor 2;Perkin-Elmer，韋爾斯利，馬薩諸塞州），使用消光濾光片（340 nm）和發射濾光片（590 nm）。

    進行1，9-二甲基亞甲基藍（DMMB;pH 3.0）測定以測量每個木瓜蛋白酶消化軟骨樣品中的硫酸糖胺聚糖（GAG）含量。使用VersaMax分光光度計在530和590nm處監測DMMB的異色反應。以鯊魚硫酸軟骨素C為標準。根據制造商的說明，使用總膠原蛋白測定法（荷蘭萊頓的QuickZyme Biosciences）測量羥脯氨酸含量以估計膠原蛋白數量。簡而言之，將木瓜蛋白酶消化物在95°C下用等體積的12M HCl水解18-20小時。使用Prockop和Udenfriend方法（Prockop和Udenfriend，1960）的修飾測量羥脯氨酸含量，并歸一化為樣品濕質量。

     根據制造商的說明，使用Fastin彈性蛋白測定（Biocolor，Carrickfergus，UK）測量軟骨樣品的彈性蛋白含量。簡而言之，軟骨樣品在加入試劑盒的染料之前，在100°C下在0.25M草酸中通過3個過夜熱提取循環轉化為水溶性α彈性蛋白。在VersaMax板讀數器上在513nm處測量吸收。來自牛頸韌帶的α彈性蛋白（由制造商提供）被用作標準。

    （4）多光子顯微鏡

     軟骨的結構信息是通過多光子激光掃描顯微鏡獲得的，使用來自未處理的軟骨的固有光信號。成像設置包括商用2光子激光掃描顯微鏡（2PLSM，TriMScope I;Lavision BioTec GmbH）和飛秒激光源（圖2（圖1D）。1激光源為飛秒Ti藍寶石激光器（相干變色龍Ultra II），在800 nm處產生約200 fs脈沖，線性偏振，重復頻率為80 MHz。激光束通過25×1.N.A.水浸物鏡（尼康APO LWD）聚焦在軟骨樣品上，橫向分辨率約為0.5μm，軸向分辨率為約2μm。將樣品上的激光功率調節在5-50 mW范圍內，以獲得足夠的信噪比并避免組織光損傷。激光束通過一對振鏡橫向掃描在樣品上。深度掃描是通過用步進電機移動物鏡來完成的。

     二次諧波（SHG）和2光子熒光（2PF）光子由膠原（SHG，2PF）和彈性蛋白（2PF）纖維以及細胞內自發熒光蛋白產生，并在表觀幾何中收集。SHG和2PF光子通過二向色鏡（色度T695lpxrxt）從800nm激發光子中過濾，然后通過二向色鏡（色度425lp）分成SHG和2PF通道，通過SHG（色度Z400 / 10X）和2PF（色度HQ500 / 140M-2P）的干涉濾光片，并通過高靈敏度GaAsP光電倍增管（Hamamatsu H7422-40）檢測（圖。（圖1E，1E， F）。

     使用TriMScope I軟件（“Imspector Pro”）進行數據采集，并以16位tiff格式存儲圖像堆棧，并使用“ImageJ”軟件（MacBioPhotonics）進一步處理和分析。

     （5）統計分析

     使用具有Bonferroni校正的混合模型分析生化差異。組間有效楊氏模量的差異是通過廣義估計方程確定的。為了測量剛度與生化含量之間的相關性，使用了二元相關性模型。所有分析均使用SPSS統計軟件版本22進行。P值小于0.05被認為是顯著的。

三、結果

（1）凹痕

    壓痕顯示耳軟骨（1.14±0.71 MPa）和鼻間隔軟骨（2.65±1.78 MPa）和鼻竇軟骨（1.26±0.51 MPa）和鼻間隔軟骨（P = 0.005）之間的硬度差異（P = 0.011）（圖。（圖 2）。2).然而，阿拉鼻與耳軟骨的比較顯示沒有顯著差異。每個軟骨類型的硬度在供體之間差異很大（參見圖，補充數字內容1，其中顯示每個軟骨類型的供體之間的硬度差異很大。

圖 2.

壓痕顯示耳軟骨和鼻間隔軟骨之間的硬度差異顯著（*P = 0.011）以及鼻竇軟骨和鼻間隔軟骨之間的硬度差異（**P = 0.005）。鼻疙瘩和耳軟骨之間未見顯著差異。

    （2）生物化學

     鼻軟骨（2.35±1.20 μg/mg干重）中基于DNA含量的細胞密度顯著高于耳朵軟骨（1.13±0.23 μg/mg干重）或鼻中隔（0.94±0.52 μg/mg干重）（P = 0.005和P = 0.001）（圖。（圖 3A）。3耳軟骨（141.40±27.2μg/mg干重）的彈性蛋白含量明顯高于鼻竇蛋白（60.12±18.35μg/mg干重）和隔膜（17.38±16.71μg/mg干重）（圖.（圖 3B）。3B）.軟骨類型間水和膠原蛋白含量無顯著差異（圖.（圖3C）。3在鼻子中，鼻中隔（96.00±23.21μg/mg干重）的GAG含量似乎略高于鼻腔（64.61±30.42μg/mg干重）（圖。（圖3）3D).

圖 3.

生化分析結果顯示軟骨類型之間的組成存在明顯差異。雖然鼻腔軟骨和鼻中隔在組織結構上具有很強的相似性，但它們在DNA和GAG含量方面存在顯著差異（P分別為0.001和P = 0.024）。鼻軟骨含有非常有限的彈性蛋白。這可能部分歸因于結締組織殘留物，盡管已謹慎地盡可能多地去除這些結締組織殘留物。

根據軟骨亞型，有效的楊氏模量與細胞密度，GAG或膠原蛋白含量沒有顯著相關性。然而，在室間隔軟骨中，彈性蛋白含量低與硬度較高有關（表（表11).

表 1.

二元相關性模型，顯示每個軟骨亞型的生化組成與剛度（有效楊氏模量）之間的相關性

   （3）多光子顯微鏡

     在矢狀面的中段對2個供體的軟骨樣本進行成像。生成的SHG和2PF顯微鏡顯示耳軟骨和鼻源軟骨之間存在顯著差異（圖。（圖 4）。4).不僅彈性蛋白纖維（綠色）的缺失明顯，鼻軟骨的一般結構也與耳朵不同。與耳軟骨的致密纖維網絡相比，來自鼻腔區域的軟骨提供更彌漫的圖像。軟骨是軟骨細胞在其細胞周圍基質內的團聚物，在兩個供體中都比鼻竇中隔大。

圖 4.

從上到下：供體樣本3和5。從左到右：阿拉納西，隔膜，耳朵。綠色：彈性蛋白;紅色：膠原蛋白。與鼻軟骨樣本中的彌漫性綠色背景信號相比，耳軟骨中的纖維結構清晰可辨。如圖所示圖 3，3，DNA含量變化很大，這在隔膜圖像的不同細胞密度中也可以辨別出來。

四、討論

  據我們所知，這是第一項比較人類供體中所有3種面部軟骨類型之間的生化，3D結構和機械差異的研究。通過在ECM水平上測量軟骨組成，結構和剛度的差異，我們旨在確定足夠的組織工程所必需的面部軟骨結構的重要方面。

    這與軟骨的組織工程有關，軟骨在過去十年中受到了廣泛的關注。已經提出了各種不同的細胞類型和支架，用于耳骨或鼻軟骨工程。24–29雖然已經獲得了有希望的結果，但大多數再生組織通常只是原始組織的非常邊緣的替換。這項研究表明，在ECM尺度上，軟骨類型之間存在顯著差異，即使它們在機械性能上相似。

    已知耳軟骨的組成與鼻間隔軟骨不同，因為它含有彈性纖維。29我們可以通過生化分析測量鼻軟骨中少量的彈性蛋白。這與新西蘭白兔的一項研究一致，該研究使用免疫組織化學染色，在耳軟骨基質中特異性地發現了高彈性蛋白含量，而在鼻間隔細胞周圍區域僅發現了中等彈性蛋白含量。30基質包含相當一部分彈性蛋白的事實表明，這可能為耳軟骨的機械質量提供重要的歸因。3

    耳窩軟骨和鼻腔軟骨的有效楊氏模量顯著低于鼻中隔軟骨。然而，耳朵和鼻軟骨之間的僵硬在統計學上沒有差異，盡管彈性蛋白含量有明顯差異。這些發現與Griffin等人的觀察結果相符。32誰發現鼻竇和鼻間隔軟骨之間的硬度差異相似。

     在最近的一篇文章中，Nimeskern等人。33探索彈性蛋白如何影響軟骨的機械行為。他們發現牛透明關節軟骨和耳軟骨的粘彈性行為不同，耳軟骨更具彈性，而關節軟骨對瞬時負荷表現出更高的抵抗力。在酶處理以去除彈性蛋白和/或GAG時，他們證明耳軟骨的壓縮機械性能似乎主要是由于彈性蛋白纖維網絡，而這些性能是由關節軟骨中的膠原蛋白提供的。此外，GAG對軟骨類型之間機械行為的影響似乎不同：在耳軟骨中，GAG對力學沒有重大影響，而在關節軟骨中，GAG具有明顯的影響。雖然組織不同，但在真皮瘢痕組織中也注意到彈性蛋白的預期作用與實際機械性能之間的這種明顯差異。34這證明了組織組成在組織的機械功能中的復雜作用。

     軟骨類型之間機械行為的差異不僅可以通過其生化成分確定，還可以通過組織結構來確定。使用多光子激光掃描顯微鏡，可以詳細描繪不同軟骨類型的3D結構。有趣的是，盡管鼻竇腸炎在外觀上與鼻間隔軟骨非常相似，彈性蛋白含量也很低，但其機械行為與耳軟骨更相似。（參見視頻，補充數字內容2，它在3D堆疊圖像視頻中顯示ala nasi軟骨結構的多光子激光掃描顯微鏡， 并查看視頻，補充數字內容3，它在3D堆疊圖像視頻中顯示隔膜軟骨結構的多光子激光掃描

     雖然在一般外觀上相似，但我們觀察到軟骨大小似乎在鼻中隔軟骨和隔膜軟骨之間有所不同。然而，樣本量很小，沒有收集到任何統計證據來支持這一方面的發現。

     供體變異性很大，并且很難將我們的數據與文獻進行一般比較，因為以前沒有進行過在機械，結構和生化方面比較這3種軟骨類型的研究。我們的數據與Nimeskern等人的觀察結果相符。29隔膜軟骨比耳軟骨更硬，含有更高的GAG，但DNA較低，表明細胞濃度較低。我們的發現也與Griffin等人進行的一項研究的結果相匹配。32與鼻中隔相比，測量鼻竇軟骨硬度較低的人。對于組織工程目的，進行壓痕實驗的尺度為細胞水平上適當的支架剛度提供了很好的參考。SHG被證明是在3D中無創地描繪膠原蛋白和彈性蛋白束結構的好工具（參見視頻，補充數字內容4，它在3D堆疊圖像視頻中顯示耳朵軟骨結構的多光子激光掃描顯微鏡。這些信息可以轉化為3D打印支架的結構模板，并與力學和生化內容數據一起為面部軟骨重建的支架優化提供了新的一步。

     我們使用高齡捐贈者的軟骨樣本（平均66.5±6歲）。年輕患者的機械行為和組織學可能因衰老過程中的鈣化和結構變化而有所不同。例如，耳朵在一生中體積持續擴大，這歸因于衰老過程中彈性纖維的變化。35然而，對于隔膜，Richmon等人。16發現年齡和性別之間的機械性能沒有顯著差異。雖然樣本來自所有供體的同一解剖位置，但可能發生了微小的變化。這是一個限制，因為一些研究表明，在單獨的軟骨類型中，含量存在區域差異。32盡管面部軟骨的定位和作為軟組織支持的可比作用表明相似的特征，但面部軟骨實際上與另一個軟骨*不同。軟骨組織的特定功能，例如，關節軟骨的壓迫和耳軟骨的柔韌性，可能需要不同的機械測試方案。我們選擇微壓痕來探索ECM的剛度;關于我們的發現，也許有必要結合機械測試才能引發各種軟骨成分的不同結構作用。在未來，包括宏觀力學測試可能會很有趣，因為大機械性狀也受到其他因素的影響，如圍鋌和解剖學形式。15，36

     從外科手術的角度來看，有趣的是，組織組成和機械行為并不總是像預期的那樣相關。我們沒有找到阿拉鼻軟骨硬度較低的解釋。它確實支持這樣一種概念，即來自不同來源的組織移植可以作為重建手術中的結構替代物。使用貝殼組織進行阿拉鼻重建就是一個很好的例子。本文未涉及但需要考慮的其他領域是細胞相互作用，包括蛋白質組學和代謝，因為細胞存活和行為是組織工程和長期成功移植的關鍵。面部軟骨類型不僅在結構上不同，而且在細胞含量上也有所不同，這一發現可能對手術重建有影響，因為具有較高細胞濃度的組織在移植時可能需要更豐富的營養環境。在我們看來，實踐經驗和基礎研究知識的融合將證明在一個組織工程迅速成為現實的世界中至關重要，這是外科醫生不容忽視的發展。

    了解組織的完整組成，結構，機械和生化，對于再生適當的支架環境以進行面部軟骨再生至關重要。這尤其反映在一個發現中，盡管其3D結構與鼻中隔軟骨相似，但鼻竇具有與耳軟骨更相似的基質硬度。有鑒于此，彈性蛋白的作用仍有待進一步引出，也許我們應該質疑它的名字在它對組織力學的貢獻方面是否沒有誤導性。