離體人體皮膚保存條件如何影響外用藥滲透性

在皮膚科外用制劑與護(hù)膚品的研發(fā)進(jìn)程中，藥物經(jīng)皮滲透數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性至關(guān)重要，它直接關(guān)系到產(chǎn)品的藥效與安全性評估。為獲得更接近實(shí)際使用情況的數(shù)據(jù)，使用人體皮膚進(jìn)行試驗(yàn)更為理想。然而，在實(shí)際研究中，新鮮人體皮膚的獲取往往面臨諸多困難，冷凍保存成為皮膚樣本儲存的常規(guī)操作。但冷凍-解凍過程是否會影響皮膚的屏障功能與藥物滲透特性，一直是行業(yè)內(nèi)爭論的焦點(diǎn)。

近期來自北里大學(xué)的Miki Wada研究團(tuán)隊(duì)發(fā)表于《Journal of Society of Cosmetic Chemists of Japan》的一項(xiàng)研究為這一爭議提供了新的證據(jù)。來自北里大學(xué)和 Mandom 公司的研究團(tuán)隊(duì)以手術(shù)切除后同一供體的新鮮眼瞼皮膚為研究對象，系統(tǒng)比較了冷凍保存與未冷凍皮膚在藥物滲透性、皮膚結(jié)構(gòu)及酶活性等方面的差異，為外用制劑研發(fā)中的皮膚樣本選擇提供了重要參考。

研究背景：皮膚保存的爭議與必要性

皮膚作為人體最大的器官，其最外層的角質(zhì)層是藥物經(jīng)皮滲透的主要屏障。角質(zhì)層的細(xì)胞間脂質(zhì)排列結(jié)構(gòu)、完整性直接影響藥物的滲透效率。在體外滲透試驗(yàn)中，皮膚樣本的質(zhì)量與保存條件是決定實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠性的關(guān)鍵因素。

目前，OECD 指南雖對皮膚吸收試驗(yàn)方法有明確規(guī)定，但未對皮膚保存條件作出詳細(xì)說明。現(xiàn)實(shí)中，由于新鮮人體皮膚供應(yīng)不穩(wěn)定且難以即時(shí)使用，研究者普遍采用冷凍保存（通常 - 80℃）的方式延長皮膚樣本的使用期限。然而，既往研究因動物種屬、冷凍溫度、保存時(shí)長等變量差異，得出的結(jié)論存在顯著分歧：部分研究認(rèn)為冷凍會破壞皮膚結(jié)構(gòu)導(dǎo)致滲透性增加，另一些研究則表明短期冷凍對皮膚屏障功能無顯著影響。

這種爭議給外用制劑研發(fā)帶來了困擾：使用低溫冷凍保存的皮膚獲得的滲透數(shù)據(jù)是否能真實(shí)反映新鮮皮膚的生理狀態(tài)？不同保存條件下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否具有可比性？為解決這些問題，本研究采用同一來源供體的眼瞼皮膚，在嚴(yán)格控制變量的前提下，開展了冷凍與未冷凍皮膚的對比研究。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

皮膚部位樣本選擇

研究團(tuán)隊(duì)選擇了面部（眼瞼）皮膚作為研究對象，試驗(yàn)所用皮膚為北里大學(xué)醫(yī)院整形外科提供的手術(shù)剩余皮膚。本研究經(jīng)北里大學(xué)內(nèi)部倫理委員會審查批準(zhǔn)，并在獲得受試者知情同意后實(shí)施。這個(gè)皮膚部位的選擇具有重要的實(shí)際意義。與常用的腹部皮膚或動物皮膚相比，眼瞼皮膚更接近外用藥物與化妝品的實(shí)際應(yīng)用部位，且角質(zhì)層較薄、屏障功能特性獨(dú)特，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具參考價(jià)值。

保存條件的對比

實(shí)驗(yàn)設(shè)置了兩組對比樣本：

• 未冷凍組：皮膚樣本在 5℃條件下用 PBS 濕潤的紗布保存，保存時(shí)長 1 - 4 天；

• 冷凍組：皮膚樣本經(jīng)橄欖油包裹后置于- 80℃冷凍保存，保存時(shí)長 1 - 4 天，使用前解凍。

這種設(shè)計(jì)排除了供體個(gè)體差異、保存時(shí)長等干擾因素，聚焦于冷凍 - 解凍過程本身對皮膚的影響。

模型藥物的代表性

研究選用兩種理化性質(zhì)差異顯著的藥物作為對象：

• 水溶性藥物：咖啡堿（CAF，CAS No. 58-08-2，MW＝194.2，logP＝－0.1），常用于經(jīng)皮滲透研究的模型化合物；

• 油溶性藥物：異丙基酚（IPMP，CAS No.3228-02-2, MW=150.2,logP=3.37），廣泛應(yīng)用于外用制劑抗菌類化合物。

通過兩種藥物的對比，可全面評估皮膚保存條件對不同極性藥物滲透的影響。

6項(xiàng)實(shí)驗(yàn)分析對比

為深入探究冷凍對皮膚的影響機(jī)制，研究設(shè)置了6個(gè)維度的檢測指標(biāo)：

1. 藥物滲透量：采用 Franz 擴(kuò)散池法，測定 1 - 24 小時(shí)內(nèi)兩種藥物的累積透皮量；

2. 皮膚內(nèi)藥物殘留：通過分層取樣，分析滲透 24 小時(shí)后表皮、真皮中的藥物殘留濃度；

3. 角質(zhì)層藥物分布：采用AST-01皮膚剝離膠帶（ASCH Japan）結(jié)合 HPLC 檢測，評估咖啡堿在角質(zhì)層不同深度的分布；通過Labodorf 850C皮膚角質(zhì)量測試儀對每個(gè)樣品的角質(zhì)進(jìn)行定量，更準(zhǔn)確反映模式藥物在角質(zhì)層中的相對含量，消除不同皮膚樣本角質(zhì)層總量差異對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。

（Labodorf 850C皮膚角質(zhì)量測試儀）

4. 屏障功能評估：通過VAPOSCAN AS-VT100經(jīng)皮水分流失測量儀（ASCH Japan）測試反映皮膚整體屏障功能。

VAPOSCAN AS-VT100經(jīng)皮水分流失測量儀（ASCH Japan）

5. 脂質(zhì)結(jié)構(gòu)分析：利用共聚焦 Raman光譜技術(shù)，解析角質(zhì)層細(xì)胞間脂質(zhì)的排列有序性；

6. 酶活性檢測：測定酯酶活性，評估皮膚生化功能的完整性。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：冷凍顯著改變皮膚滲透特性

冷凍皮膚的藥物滲透性顯著提高

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種藥物在冷凍皮膚中的累積滲透量均顯著高于未冷凍皮膚。對于咖啡堿，在 4、6、8 小時(shí)三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，冷凍皮膚的滲透量顯著更高；對于異丙基酚，這一差異在 6、8、24 小時(shí)更為明顯。這一結(jié)果表明，冷凍 - 解凍過程會導(dǎo)致皮膚對水溶性和油溶性藥物的滲透性普遍增強(qiáng)，且這種增強(qiáng)效應(yīng)隨時(shí)間推移更加顯著。

這一發(fā)現(xiàn)對制劑研發(fā)具有參考意義：若采用冷凍皮膚進(jìn)行滲透試驗(yàn)，可能會高估藥物的實(shí)際滲透效率，尤其是對于需要長期評估的制劑。

隨時(shí)間推移，冷凍及新鮮皮膚中 CAF 和 IPMP 的累積量。所示數(shù)值為 11 - 14 個(gè)皮膚樣本的平均值（●：冷凍皮膚，○：新鮮皮膚，*t 檢驗(yàn)：p < 0.05）。

藥物在皮膚內(nèi)的分布存在差異

滲透試驗(yàn) 24 小時(shí)后，皮膚各層的藥物殘留分析揭示了更細(xì)微的差異：

• 表皮中，未冷凍皮膚的咖啡堿殘留量顯著高于冷凍皮膚，而異丙基酚的殘留量無顯著差異；

• 真皮中，兩種藥物在兩組皮膚中的殘留量均無顯著差異。

滲透測試24小時(shí)后，表皮/真皮中CAF/IPMP的殘留量。CAF/IPMP的量通過皮膚重量進(jìn)行了歸一化處理。所示數(shù)值為6 - 8個(gè)皮膚樣本的平均值。t檢驗(yàn)：p < 0.05。

進(jìn)一步的角質(zhì)層分層研究顯示，未冷凍皮膚的角質(zhì)層各深度（1-5 層至16-20 層）咖啡堿殘留量均高于冷凍皮膚。且未冷凍皮膚的咖啡堿殘留量隨角質(zhì)層深度增加而逐漸降低，符合正常的藥物滲透梯度；而冷凍皮膚的咖啡堿殘留量在各深度分布較為均勻，提示角質(zhì)層的屏障梯度可能已被破壞。

6小時(shí)滲透測試后角質(zhì)層中CAF的殘留量。該數(shù)值顯示了五個(gè)剝離膠帶總和的CAF含量。CAF含量通過角質(zhì)層蛋白量進(jìn)行了歸一化處理。展示了兩個(gè)皮膚樣本的平均值。

這些結(jié)果表明，冷凍可能通過改變角質(zhì)層的藥物滯留能力，影響藥物的經(jīng)皮轉(zhuǎn)運(yùn)過程。水溶性藥物受冷凍影響更為明顯，可能與角質(zhì)層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)對水溶性物質(zhì)的阻滯作用更易受物理損傷有關(guān)。

角質(zhì)層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂對藥物滲透的影響

共聚焦 Raman 光譜分析為冷凍影響皮膚屏障功能提供了直接證據(jù)。角質(zhì)層細(xì)胞間脂質(zhì)的有序性可通過特征峰強(qiáng)度比I₁₀₈₀/(I₁₀₆₀+I₁₁₃₀)評估，該比值越低，脂質(zhì)排列越有序。

結(jié)果顯示，在角質(zhì)層表面（0 - 2μm），兩組皮膚的脂質(zhì)有序性無顯著差異；但在中深層（4 - 16μm），冷凍皮膚的特征峰比值顯著高于未冷凍皮膚，表明其脂質(zhì)結(jié)構(gòu)有序性降低、出現(xiàn)明顯紊亂。這種結(jié)構(gòu)破壞可能是導(dǎo)致藥物滲透性增加的原因：脂質(zhì)排列紊亂使藥物更容易通過細(xì)胞間隙擴(kuò)散。

利用峰強(qiáng)度比I₁₀₈₀/(I₁₀₆₀+I₁₁₃₀)通過拉曼散射測定的角質(zhì)層細(xì)胞間脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的深度分布。所示數(shù)值為6-8個(gè)測定點(diǎn)的平均值（●：冷凍皮膚，○：新鮮皮膚，t檢驗(yàn)：p < 0.05）。

值得注意的是，經(jīng)皮水分流失量（TEWL）測定未發(fā)現(xiàn)兩組皮膚的顯著差異。這提示 TEWL 作為整體屏障功能的評估指標(biāo)，可能無法靈敏捕捉角質(zhì)層局部結(jié)構(gòu)的細(xì)微變化，而 Raman 光譜等微觀結(jié)構(gòu)分析技術(shù)更具優(yōu)勢。

酯酶活性不受冷凍影響

皮膚中的酯酶活性是評估皮膚生化功能的重要指標(biāo)，與藥物的代謝轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，冷凍與未冷凍皮膚的酯酶活性無顯著差異，表明冷凍 - 解凍過程未對皮膚的酶促反應(yīng)能力未造成明顯影響。

這一發(fā)現(xiàn)具有積極意義：對于需要考慮皮膚代謝因素的滲透研究，冷凍皮膚可在一定程度上保留酶活性，其代謝相關(guān)數(shù)據(jù)仍具有參考價(jià)值。

研究啟示：對制劑研發(fā)的實(shí)用指導(dǎo)

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)需統(tǒng)一皮膚保存條件

本研究明確證實(shí)，皮膚保存條件會顯著影響藥物滲透數(shù)據(jù)。因此，在外用制劑研發(fā)的體外滲透試驗(yàn)中，應(yīng)嚴(yán)格統(tǒng)一皮膚樣本的保存條件：

• 若需比較不同配方的滲透效率，所有實(shí)驗(yàn)必須使用相同保存狀態(tài)（均冷凍或均未冷凍）的皮膚；

• 研究報(bào)告中應(yīng)詳細(xì)注明皮膚的來源、保存溫度、保存時(shí)長及解凍方法，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性與可比性。

不同類型藥物需差異化評估

研究顯示，水溶性藥物與油溶性藥物受冷凍的影響程度存在差異。在實(shí)際研發(fā)中：

• 對于水溶性成分占主導(dǎo)的制劑（如保濕類護(hù)膚品、水溶性抗生素軟膏），需特別關(guān)注冷凍對滲透數(shù)據(jù)的高估風(fēng)險(xiǎn)；

• 對于油溶性成分制劑，雖冷凍影響相對較小，但仍需謹(jǐn)慎解讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果，必要時(shí)結(jié)合新鮮皮膚數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。

優(yōu)化皮膚保存與實(shí)驗(yàn)方法

基于研究結(jié)果，可對現(xiàn)有皮膚處理方法進(jìn)行優(yōu)化：

• 短期保存（1 - 4 天）可優(yōu)先選擇 5℃冷藏而非冷凍，以更好地保留皮膚的天然屏障特性；

• 若必須冷凍保存，建議采用橄欖油等保護(hù)劑減少冰晶形成對脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的損傷；

• 在滲透試驗(yàn)中引入 Raman 光譜等結(jié)構(gòu)分析技術(shù)，結(jié)合傳統(tǒng)滲透數(shù)據(jù)，更全面評估皮膚樣本質(zhì)量。

推動行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的*

目前 OECD 等指南對皮膚保存條件的模糊規(guī)定是導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異的重要原因。本研究結(jié)果支持在相關(guān)指南中加入更明確的皮膚保存規(guī)范，如推薦保存溫度、最長保存時(shí)長、質(zhì)量驗(yàn)證方法等，促進(jìn)行業(yè)研究數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化與可比性。

研究局限與未來方向

盡管本研究設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)，但仍存在一定局限性：樣本量較小且僅使用眼瞼皮膚，不同部位（如腹部、背部）皮膚的冷凍響應(yīng)可能存在差異；保存時(shí)長限定在 1 - 4 天，長期冷凍（如數(shù)月）的影響尚未評估；未深入探究冷凍導(dǎo)致脂質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂的分子機(jī)制。

未來研究可從以下方向展開：

• 擴(kuò)大樣本來源，比較不同部位皮膚對冷凍的響應(yīng)差異；

• 延長觀察周期，研究長期冷凍對皮膚結(jié)構(gòu)與功能的影響；

• 結(jié)合小角 X 射線散射等技術(shù)，更精細(xì)地解析冷凍對脂質(zhì)層狀結(jié)構(gòu)的影響；

• 探索優(yōu)化的冷凍保護(hù)劑配方，減少冷凍對皮膚屏障功能的損傷。

結(jié)語

皮膚保存條件對藥物滲透性的影響長期以來存在爭議，本研究通過一系列實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)冷凍 - 解凍過程會通過破壞角質(zhì)層細(xì)胞間脂質(zhì)的有序結(jié)構(gòu)，增加皮膚對水溶性和油溶性藥物的滲透性，且對藥物在皮膚內(nèi)的分布產(chǎn)生顯著影響。

這些發(fā)現(xiàn)對外用制劑研發(fā)具有指導(dǎo)價(jià)值，提醒研究者在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中充分考慮皮膚保存條件的影響，通過標(biāo)準(zhǔn)化操作與檢測技術(shù)的結(jié)合，提高滲透數(shù)據(jù)的可靠性。隨著研究的深入與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的*，未來的外用制劑研發(fā)將更加精準(zhǔn)、高效，為患者提供更安全有效的產(chǎn)品。

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