進(jìn)行大鼠磷酸肌醇3激酶（PI3K）的ELISA檢測(cè)，需遵循標(biāo)準(zhǔn)化的雙抗體夾心法流程，確保結(jié)果準(zhǔn)確、可重復(fù)。

 一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備（約30分鐘）

?試劑與耗材檢查?

確認(rèn)試劑盒組分齊全：酶標(biāo)板、標(biāo)準(zhǔn)品、酶標(biāo)試劑、顯色劑A/B、終止液、濃縮洗滌液、樣品稀釋液、封板膜等 。

所有試劑使用前?室溫平衡20–30分鐘?（18–25℃），避免溫度差異影響反應(yīng)動(dòng)力學(xué) 。

檢查濃縮洗滌液是否有結(jié)晶，如有，可?37℃水浴加熱溶解并充分混勻? 。

?樣本預(yù)處理?

?血清/血漿?：采集后1000×g離心10–30分鐘，取上清，避免溶血或脂濁 。

?組織勻漿?：按1:9比例加入含蛋白酶抑制劑的PBS（pH 7.4），冰浴勻漿后，5000×g離心10分鐘取上清 。

?細(xì)胞上清?：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除碎片 。

所有樣本建議?分裝保存于-80℃?，避免反復(fù)凍融 。

?標(biāo)準(zhǔn)品配制?

凍干標(biāo)準(zhǔn)品加入1mL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，室溫靜置10分鐘，反復(fù)顛倒/搓動(dòng)助溶，濃度為2000 pg/mL 。

按說明書進(jìn)行梯度稀釋（如0、15、30、60、120、180 pmol/L或?qū)?yīng)pg/mL單位），?現(xiàn)配現(xiàn)用?，不可重復(fù)使用 。

?儀器準(zhǔn)備?

酶標(biāo)儀校準(zhǔn)至450nm波長(zhǎng)；

恒溫培養(yǎng)箱設(shè)定為37℃；

移液器校準(zhǔn)，尤其小體積（<50μL）操作。

 二、正式檢測(cè)流程（總耗時(shí)約3.5–4小時(shí)）

1. ?加樣?（5分鐘內(nèi)完成）

設(shè)置孔位：

?空白孔?：不加樣品和酶標(biāo)試劑，僅加稀釋液；

?標(biāo)準(zhǔn)品孔?：每孔加50μL不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品；

?待測(cè)樣本孔?：先加40μL樣品稀釋液，再加10μL樣本（終稀釋倍數(shù)為5倍） 。

加樣技巧：

垂直插入孔底，緩慢釋放液體，避免氣泡；

使用多通道移液器提高效率與一致性。

2. ?輪溫育?（30–60分鐘）

用封板膜密封酶標(biāo)板，?37℃恒溫避光孵育30–60分鐘?（具體時(shí)間依試劑盒說明） 。

目的：使樣本中的PI3K與固相抗體充分結(jié)合。

3. ?洗滌?（10分鐘）

揭去封板膜，棄去孔內(nèi)液體；

每孔加入?洗滌液300–350μL?，靜置30秒后甩干；

重復(fù)洗滌?5次?，在吸水紙上?輕拍3次?，去除殘留液滴 。

4. ?加酶標(biāo)試劑?（5分鐘）

每孔加入?HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體50μL?（空白孔除外）；

輕輕震蕩混勻，避免起泡 。

5. ?第二輪溫育?（30–60分鐘）

重新封板，?37℃避光溫育30–60分鐘?；

此步形成“固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體"復(fù)合物。

6. ?第二次洗滌?（10分鐘）

同第3步，洗滌5次并拍干。

7. ?顯色?（15–30分鐘）

每孔加入?顯色劑A液50μL + 顯色劑B液50μL?，輕震混勻；

?37℃避光顯色15–30分鐘?（嚴(yán)格控制時(shí)間，防止過顯或顯色不足） 。

8. ?終止反應(yīng)?（立即進(jìn)行）

每孔加入?終止液50μL?，此時(shí)藍(lán)色立即轉(zhuǎn)為黃色 ；

終止后應(yīng)在?15分鐘內(nèi)完成讀數(shù)?，防止顏色衰減影響準(zhǔn)確性。

9. ?檢測(cè)與計(jì)算?（5–10分鐘）

使用酶標(biāo)儀在?450nm波長(zhǎng)?下測(cè)定各孔OD值；

以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

通過回歸方程計(jì)算樣本中PI3K的實(shí)際濃度，并乘以稀釋倍數(shù)得到原始濃度。