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基因的編輯調控技術—轉染，您了解多少？

閱讀：2732 發(fā)布時間：2022-12-6

轉染——是將外源基因如DNA、RNA導入真核細胞的技術。是真核細胞在一定條件下主動或被動導入外源基因而獲得新的表型的過程。隨著分子生物學和細胞生物學研究的不斷發(fā)展，轉染已經(jīng)成為研究和控制真核細胞基因功能的常規(guī)工具。在研究基因功能、基因表達調控、突變分析和蛋白質生產(chǎn)等領域中，轉染技術的應用越來越廣泛。

圖1 轉染

轉染的分類

根據(jù)外源性基因在真核細胞中表達時間的長短我們可將轉染技術可分為瞬時轉染和穩(wěn)定轉染兩種。在瞬時轉染的細胞中，外源基因得以表達但它們并不會整合到細胞的基因組中，也就不會被復制，適用的核酸類型主要包括質粒DNA、siRNA、miRNA和mRNA。細胞瞬時轉染的外源基因表達時間有限，通常僅持續(xù)幾天，直到外源基因在細胞分裂過程中因各種因素丟失為止。穩(wěn)定轉染是建立在瞬時轉染的基礎上的，先對細胞進行轉染，再對得到的細胞進行篩選，在少數(shù)轉染細胞中，外源基因能夠整合到細胞的基因組中。適用的核酸類型只有質粒DNA，且外源基因成為細胞基因組的一部分從而得以復制，這就是穩(wěn)定轉染細胞的標志。穩(wěn)定轉染細胞的子代細胞也同樣表達外源基因，由此形成穩(wěn)定轉染的細胞系。

圖2 瞬時轉染和穩(wěn)定轉染的區(qū)別

常規(guī)細胞轉染的途徑

1．化學介導法

主要是使用載體分子去中和或者使帶負電的核酸帶正電荷，讓核酸更容易進入細胞內。主要包括DEAE-葡聚糖法、磷酸鈣法、陽離子脂質體法、陽離子聚合物法等。

化學介導法	原理	主要應用	特點
DEAE-葡聚糖法	帶正電的DEAE-葡聚糖與核酸帶負電的磷酸骨架相互作用形成的復合物被細胞內吞	瞬時轉染	相對簡便、重復比磷酸鈣好，但對細胞有一定的毒副作用，轉染時需除血清且一般只用于BSC-1、CV-1、COS細胞系
磷酸鈣法	磷酸鈣DNA復合物吸附細胞膜被細胞內吞	穩(wěn)定轉染、瞬時轉染	不適用于原代細胞(所需的DNA濃度較高)，操作簡便但重復性差，有些細胞不適用。細胞建議用CSCL梯度離心，轉染時拷貝數(shù)較多
人工脂質體法	帶正電的脂質體與核酸帶負電的磷酸基團形成復合物，然后脂質體上剩余的電核與細胞膜上的唾液酸殘基的負電核結合	穩(wěn)定轉染、瞬時轉染	使用方法簡單，可攜帶大片段DNA，通用于各種類型的裸露DNA或RNA，能轉染各種類型的細胞，沒有免疫原性。雖在體外基因轉染中有很高的效率，但在體內，能被血清清除，并在肺組織內累積，誘發(fā)強烈的抗炎反應，導致高水平的毒性，這在很大程度上限制了其應用
陽離子聚合物	帶正電的聚合物與核酸帶負電的磷酸基團形成帶正電的復合物后與細胞表面帶負電的蛋白多糖相互作用，并通過內吞作用進入細胞	穩(wěn)定轉染、瞬時轉染所有細胞	除了具有陽離子脂質體的轉染效率高、操作簡單、適用范圍廣、重復性好等特點外，還具有在體內、轉染效率高、細胞毒性低等特點，是新一代的轉染方法

2．物理介導法

物理介導法是將核酸直接遞送到細胞質或細胞核中。主要包括電轉染、顯微注射法、基因槍法。

物理介導法	原理	主要應用	特點
電轉染	通過高脈沖電壓破壞細胞膜電，DNA通過膜上形成的小孔導入細胞內	穩(wěn)定轉染、瞬時轉染所有細胞	適用性廣，除了質粒外還可轉染大的基因組(>65kb)，但細胞致死率高，DNA和細胞用量大，需根據(jù)不同細胞類型優(yōu)化電穿孔實驗條件，拷貝數(shù)較少只有1-20
顯微注射法	用顯微操作將DNA直接注入靶細胞核	穩(wěn)定轉染、瞬時轉染	轉染細胞數(shù)有限，多用于工程改造或轉基因動物的胚胎細胞
基因槍法	將DNA用顯微重金屬顆粒沉淀，再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細胞，DNA在胞內逐步釋放、表達	穩(wěn)定轉染、瞬時轉染	可用于的細胞類型有：人的表皮細胞，纖維原細胞，淋巴細胞系以及原代細胞

3．生物介導法

又稱之為病毒介導法，是利用包裝了外源基因的病毒感染細胞的方法使得其進入細胞。病毒介導法轉染效率很高，尤其是針對難轉染的活體細胞、原代細胞。主要包括慢病毒、逆轉錄病毒、腺病毒等病毒介導法。

生物介導法	病毒基因	原理	主要應用	特點
慢病毒	RNA病毒	包裝系統(tǒng)由包裝成分和載體成分組成。將包裝成分與載體成分的多個質粒共轉染包裝細胞，即可在細胞上清中收獲攜帶目的基因的復制的慢病毒載體顆粒。包裝好的病毒顆粒可以直接用于宿主細胞的感染，目的基因進入到宿主細胞之后，經(jīng)過反轉錄，整合到基因組，從而高水平的表達效應分子	穩(wěn)定轉染特定宿主細胞	可以感染分裂期和非分裂期細胞、容納外源性基因片段大，可以長期表達等顯著優(yōu)點。
逆轉錄病毒	RNA病毒	通過病毒中膜糖蛋白和宿主細胞表面的受體相互作用而進入宿主細胞，之后反轉錄酶啟動合成DNA并隨機整合到宿主基因組中	穩(wěn)定轉染特定宿主細胞	可用于難轉染的細胞、原代細胞，體內細胞等，但攜帶基因不能太大(<8kb)，細胞需處分裂期，需考慮安全因素
腺病毒	雙鏈DNA病毒	先和細胞表面的受體結合，繼而被細胞內吞	瞬時轉染特定宿主細胞	可用于感染分裂期和非分裂期細胞、難轉染的細胞，需考慮安全因素

圖6 細胞轉染的途徑

細胞轉染相關實驗

圖7 細胞轉染流程圖

以質粒DNA為例介紹細胞轉染的流程(24孔板、貼壁細胞、核酸轉染試劑盒(貨號：abs60259))：

實驗材料

1.1儀器設備

CO₂培養(yǎng)箱、超凈工作臺、倒置顯微鏡、臺式冷凍離心機、水浴鍋、醫(yī)用冰箱、-80℃冰箱、移液器(一套)、細胞計數(shù)儀等。

1.2試劑耗材
DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、磷酸緩沖溶液(PBS)、胰酶、核酸轉染試劑盒(abs60259)、24孔板、1.5ml無菌離心管若干等。

實驗步驟

Step1 細胞接種:

1．轉染前一天對細胞進行轉接，每孔接種1.5-2.0×10⁵個細胞，使轉染時細胞密度為90%左右，且生長良好(非常重要)；

2．最好在轉染開始之前更換新鮮的含血清培養(yǎng)基，以防轉染后孵育階段細胞密度太大、營養(yǎng)不足導致細胞死亡。

Step2 試劑A/DNA轉染復合物制備(該步完成后應立即進行轉染):

1．在1.5 ml無菌離心管A中加入50µl無血清培養(yǎng)基，再加入適量的轉染試劑A，見下表8。用移液器輕輕混勻后在室溫靜置5分鐘。

2．在1.5 ml無菌離心管B中加入50µl無血清培養(yǎng)基，并加入適量的試劑B，輕輕混勻，再加入適量的DNA，見下表8。用移液器再次輕輕混勻后在室溫靜置5分鐘。

3．將DNA-培養(yǎng)基混合物滴加至試劑A-培養(yǎng)基混合物中，用移液器輕輕混勻后在室溫靜置15~20分鐘后，立即轉染。

注意： 1. 試劑A-培養(yǎng)基混合物和DNA-培養(yǎng)基混合物的混合次序非常重要，切勿顛倒。

2. 離心管最好使用聚丙烯離心管。

Step3 轉染:

1．將Step2制備的轉染復合物滴加至培養(yǎng)基中，邊加邊輕輕晃動培養(yǎng)板以使復合物均勻分布。加完后，立即將培養(yǎng)板轉入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

2．培養(yǎng)12小時后即可觀察，最佳觀察或收獲時間為24~48小時。

3．試劑A在培養(yǎng)基中仍有較高的轉染效率，因此轉染前后不需要換成無血清或低血清培養(yǎng)基。

培養(yǎng)皿		96孔板	48孔板	24孔板	12孔板	6孔板	10cm皿
培養(yǎng)基、試劑、DNA量	無血清培養(yǎng)基(μl)	2x10	2x25	2x50	2x100	2x200	2x1000
	試劑A(μl)	0.5	1.3	2.5	5	10	50
	試劑B(μl)	0.4	1	2	4	8	40
	1ug/ul plasmid(μl)	0.16	0.4	0.8	1.6	3.2	16
培養(yǎng)基		0.1	0.25	0.5	1	2	10

表8 質粒轉染不同培養(yǎng)體系推薦初始轉染條件

影響細胞轉染效果的因素

(1) 細胞密度

細胞密度對轉染效率有一定的影響。不同的轉染試劑，要求轉染時的最適細胞密度各不相同，即使同一種試劑，也會因不同的細胞類型或應用而異。轉染時過高或者過低的細胞密度會導致轉染效率降低，乃至表達水平偏低。因此如果選用新的細胞系或者新的轉染試劑，最好能夠進行優(yōu)化實驗并為以后的實驗建立一個穩(wěn)定方法，包括適當?shù)慕臃N量和培養(yǎng)時間等。陽離子脂質體試劑具有微量的細胞毒性而往往需要更高的鋪板密度或者更多的懸浮細胞數(shù)，有的要求細胞達到90%匯合度；而研究細胞周期等表達周期長的基因，就需要較低的鋪板密度，所以需要選擇能夠在較低鋪板密度下進行轉染的試劑。一般轉染時貼壁細胞密度大致為50%-90%，但這個需要參考所選轉染試劑的說明書。

(2) 細胞生長狀態(tài)

這點非常關鍵，很多時候傳代次數(shù)太少或者太多都將導致細胞對轉染試劑敏感度的改變。因此，為了提高轉染效率以及轉染穩(wěn)定性、降低細胞毒性，應盡量使用適度傳代、生長狀態(tài)良好的細胞系。轉染的細胞是經(jīng)過幾次傳代后達到指數(shù)生長期的細胞，細胞生長旺盛,最容易轉染。

(3) 細胞種類、轉染試劑、轉染方法

不同細胞種類的細胞在做轉染時轉染效率通常不同，因此所需要的轉染體系是不同的，不能一種轉染體系用在所有類型細胞的轉染實驗。實驗前應根據(jù)實驗要求和細胞特性選擇適合的轉染試劑。每種轉染試劑都有不同的轉染方法，但大都大同小異，同時目前產(chǎn)品都會提供一些已經(jīng)成功轉染的細胞株列表和文獻，通過這些資料可選擇實驗設計的轉染試劑。另外，在大規(guī)模使用前，仍需進行轉染試劑和核酸比例的實踐摸索。

(4) 核酸類型及質量

用于轉染的核酸類型一般有質粒DNA、mRNA 、sirNA和miRNA，針對不同的核酸一般采用不同的轉染試劑和轉染方法。另外在制備高純度DNA時，還需要對DNA進行內毒素的去除，內毒素的存在會造成細胞毒性，嚴重影響轉染效率。同時DNA質量對轉染的效果影響也非常大，一般轉染技術是基于電荷吸引原理，如果DNA不純，帶有污染物都會顯著影響轉染復合物的的形成。

圖9 細胞轉染圖

本期小愛推薦

轉染類產(chǎn)品推薦

貨號	產(chǎn)品名稱	規(guī)格
abs60259	核酸轉染試劑盒	0.5ml/1.0ml/1.5ml
abs60255	質粒DNA轉染試劑盒(貼壁細胞)	0.5ml/1.0ml/1.5ml
abs60256	PM原代細胞質粒DNA轉染試劑盒	0.5ml/1.0ml/1.5ml
abs60257	溶液A(轉染增強劑，僅用于質粒DNA轉染)	0.25ml/0.5ml/1ml
abs60317	核酸共轉染試劑	0.5ml/1.0ml/1.5ml
abs60322	Lipofect5000質粒轉染試劑	0.5ml/1.0ml
abs60324	PM原代細胞核酸轉染試劑盒	0.5ml/1.0ml/1.5ml
abs60325	SP懸浮細胞核酸轉染試劑盒	0.5ml/1.0ml/1.5ml
abs60327	SP懸浮細胞質粒DNA轉染試劑盒	0.5ml/1.0ml/1.5ml

細胞培養(yǎng)類產(chǎn)品推薦

貨號	品名	規(guī)格
abs47047834	胰酶	100g/500g
abs961	10×PBS緩沖液	500ml/500ml×10
abs9468	RPMI 1640 培養(yǎng)基(ATCC 改良)	500ml
abs9484	RPMI-1640培養(yǎng)基	500ml/500ml×10
abs9483	高糖 DMEM 培養(yǎng)基(含 L-谷氨酰胺和丙酮酸鈉)	500ml/500ml×10
abs9501	無糖 DMEM 培養(yǎng)基(不含HEPES、L-谷氨酰胺和丙酮酸鈉，含酚紅)	500ml/500ml×10
abs972	胎牛血清(優(yōu)級)	125ml/500ml
abs973	胎牛血清(優(yōu)級),輻照	125ml/500ml
abs974	胎牛血清(標準級)	125ml/500ml
abs975	胎牛血清(標準級),輻照	125ml/500ml
abs7004	細胞培養(yǎng)皿(35mm)	500個/箱
abs7005	細胞培養(yǎng)皿(60mm)	500個/箱
abs7003	細胞培養(yǎng)皿(100mm)	500個/箱
abs7033	標準透明6孔細胞培養(yǎng)板	50個/盒
abs7034	標準透明12孔細胞培養(yǎng)板	50個/箱
abs7035	標準透明24孔細胞培養(yǎng)板	50個/盒
abs7040	標準透明48孔細胞培養(yǎng)板	50個/箱
abs7036	標準透明96孔細胞培養(yǎng)板	50個/盒
abs7119	1.5ml離心管(無菌無酶)	500支/盒,10盒/箱(1袋/盒)

基因的編輯調控技術—轉染，您了解多少？

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