肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，在全國城市人口惡性腫瘤死亡原因中位居前位，非小細胞肺癌（NSCLC）患者約占肺癌患者的85%，其中肺腺癌（LUAD）、肺鱗狀細胞癌（LUSC）又屬于其中最常見的類型。近幾年，惡性腫瘤的免疫治療取得了很大進展，但惡性腫瘤往往具有復雜的瘤內異質性（ITH），且傳統的測序手段無法更深層次地探索這種復雜性，一定程度上對免疫治療的深入研究產生了一些阻礙，因此即使在免疫治療備受推崇的當今，仍有許多患者無法從中獲益。

2023年2月，同濟大學醫學院的周彩存教授團隊在Journal for ImmunoTherapy of Cancer在線發表了題為“Spatial multi-omics revealed the impact of tumor ecosystem heterogeneity on immunotherapy efficacy in patients with advanced non-small cell lung cancer treated with bispecific antibody"的研究論文，研究團隊通過數字空間分析技術（DSP）進行空間分割，用于發現晚期非小細胞肺癌的瘤內異質性（ITH），并區分來自腫瘤或基質區域的療效相關生物標志物。 空間分割后，基質區域顯示出更多的遺傳信息，這有助于更好地預測免疫療法的療效。

研究結果（Results）：

1、晚期非小細胞肺癌（aNSCLC）的空間轉錄組和蛋白質組分析

研究團隊將形態學標記染色與數字光學條形碼技術相結合，將腫瘤或間質細胞與周圍細胞分離，將圈選的感興趣的區域（ROI）進一步分割成腫瘤或間質小區域（AOI），再進行蛋白質和RNA的DSP檢測，比較分析顯示，RNA和蛋白質的表達呈中等正相關。

圖1 DSP技術路線示意

2、應用DSP識別腫瘤內AOI的不同表達模式

為了評估ITH，研究團隊分析了每個樣本在空間上不同的AOI中蛋白質和RNA的表達模式，發現來自同一樣本的腫瘤和間質AOI在蛋白質和RNA水平上都有顯著差異，應用DSP技術進一步研究與腫瘤和間質區域相關的特定分子標記，結果顯示免疫細胞標志物在間質區顯著增加，免疫細胞圖譜核心和免疫細胞分型模塊在間質AOI中的特征分數顯著較高。為了在空間水平上進一步研究ITH，研究團隊對每個樣本中不同區域的分子輪廓進行了表征，選擇12個在空間距離上不同AOI之間有明確位置關系的腫瘤樣本進行分析，其中8個樣本的腫瘤AOI的空間距離與分子聚集模式一致；此外還通過分子聚類推斷不同區域之間的關系反映腫瘤的發展路徑。接下來，研究團隊還使用了從同一區域分割的成對的腫瘤和間質AOI進行進一步分析，發現從同一ROI分割的腫瘤與間質區域之間的相關性顯著高于不同ROI，而在蛋白質和RNA水平上，則發現腫瘤AOI之間的相關性很強。

圖2 應用DSP識別腫瘤內空間不同AOI的不同表達模式

3、DSP能夠將生物觀察結果分配給復雜腫瘤生態系統中特定表型細胞類型

為了評估淋巴細胞的滲透，研究團隊使用DSP對標記不同免疫細胞類型的轉錄本進行了量化，觀察到腫瘤AOI中的淋巴細胞豐度明顯低于間質AOI，巨噬細胞、CD4T細胞、成纖維細胞、單核細胞、B細胞和CD8T細胞是間質AOI中檢出最多的細胞類型；隨后分析不同區域之間與免疫反應相關的細胞，發現淋巴細胞轉運和淋巴細胞調節信號評分與間質AOI相關。研究團隊還評估了每個患者體內AOI的表達程序，表明了與癌癥相關的細胞功能、信號通路和新陳代謝。

4、DSP標記物的鑒定揭示了ITH對尋找與治療效果相關的候選生物標記物的影響

DSP蛋白數據和模擬批量測序數據一致表明，PR組CD45、CD4、GITR、CD11c的表達均增加。間質區、腫瘤區和模擬批量測序數據中大多數蛋白質標志物PR/PD的折疊變化與上述結果一致，有幾個蛋白質出現差異。為了進一步驗證蛋白質在不同區域的表達，研究團隊選取PR組和PD組的3個樣本進行CD11c、Tim-3、CD45、CD4四標五色mIHC驗證，并與間質區域進行比較，結果表明，PR組間質區上述4種蛋白的表達均顯著高于PD組。

圖3 mIHC染色結果

此外，研究團隊發現腫瘤和免疫DSP標記物之間的相關性是可區分的，這表明腫瘤和免疫細胞群對治療效果的不同反應；評估不同應答組患者間質區域的免疫滲透情況，發現PR組四種免疫細胞的豐度顯著高于PR組，同時，IO藥物、基質的泛腫瘤特征評分等各項分析也顯示PR患者中腫瘤區域的比例顯著較高。

研究團隊進一步分析不同治療方法中腫瘤和間質的變化，結果顯示經KN046治療后，活化的白細胞黏附分子（ALCAM）和角蛋白5水平顯著升高，指示ALCAM的高表達與NSCLC的預后不良有關。隨后，團隊利用相關基因構建panel，探討治療前后免疫耗竭相關通路的差異，發現在抵抗bsAb-KN046后，免疫耗竭特征顯著降低。

5、基質區域的空間分辨特征比腫瘤區域具有更大的臨床反應相關性

研究團隊根據療效相關的DSP蛋白標記物計算空間分辨標記的分數，發現PD患者和PR患者在腫瘤和基質區域的特征評分存在顯著差異；多因素Cox回歸顯示間質和腫瘤信號是影響臨床結果的有利因素；與腫瘤標志物和傳統生物標志物，如PD-L1和TMB相比，來自間質的標志物顯示出更強的臨床相關性；基質特征評分高的患者比評分低的患者具有更長的中位OS。

為了確定基質區域的特征在預測一般免疫療法的療效方面是否仍然有效，研究團隊驗證了用從公共數據集中的65名接受ICI治療的獨立NSCLC患者的基質區域中識別的相關基因構建的空間解析特征，結果顯示，來自間質區域的分子在評估免疫治療的臨床療效方面可能有更大的潛力。

圖4  構建空間分辨特征以預測免疫治療的臨床反應

結語：

本項研究充分運用DSP空間轉錄組技術并巧妙結合多重熒光免疫組化，旨在破譯復雜的瘤內異質性（ITH），最終為晚期非小細胞肺癌的免疫治療提供一些新思路。

Song X, Xiong A, Wu F, Li X, Wang J, Jiang T, Chen P, Zhang X, Zhao Z, Liu H, Cheng L, Zhao C, Wang Z, Pan C, Cui X, Xu T, Luo H, Zhou C. Spatial multi-omics revealed the impact of tumor ecosystem heterogeneity on immunotherapy efficacy in patients with advanced non-small cell lung cancer treated with bispecific antibody. J Immunother Cancer. 2023 Feb;11(2):e006234. doi: 10.1136/jitc-2022-006234. PMID: 36854570; PMCID: PMC9980352.

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