腦卒中俗稱中風，是全球成人致殘和死亡的主要原因之一，導致腦卒中的原因主要是動脈粥樣硬化、房顫、高血壓、糖尿病等疾病引起的腦血流灌注中斷。腦卒中可分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中，前者最常見，約占腦卒中的80%。在缺血性卒中期間，谷氨酸的大量釋放可激活NMDARs（N-甲基-D-天冬氨酸受體），誘導鈣離子通過這些離子通道流入神經元，使神經元超載并破壞其鈣同源穩定。盡管科學家們對缺血性損傷已經有了廣泛的研究，但切實有效的藥物暫時還沒有，因此迫切需要確定中風的機制并尋找有效治療缺血性腦卒中的潛在新靶點。

2023年3月14日，上海交通大學殷善開、史海波及多倫多大學Wang Lu-Yang團隊在Neuron上在線發表題為“Bilirubin gates the TRPM2 channel as a direct agonist to exacerbate ischemic brain damage"的研究結果，提出膽紅素作為內源性激動劑可以直接阻斷TRPM2通道的開放，進而加重缺血性中風的腦損傷。通過動物實驗，研究團隊發現對小鼠模型進行分子干預和TRPM2通道封閉，可以起到很好的神經保護作用。

主要研究結果 (Results) ：

1、中風患者和小鼠模型中腦梗塞面積與膽紅素水平的關系

膽紅素在中風中的作用存在爭議，血清膽紅素水平高的患者表現出更嚴重的神經癥狀，而磁共振成像可以準確確定缺血的位置和大小。對不同中風患者的臨床記錄進行分析，發現患有乙肝的中風患者的血清總膽紅素 (TB) 水平和直接膽紅素 (DB) 水平比正常組高2至3倍，中風顯著增加了TB和DB濃度，表明膽紅素水平升高可能是中風的結果，與梗塞體積呈正相關。

先前的研究指出，在缺血條件下，細胞內Ca²⁺濃度升高引起ROS過量產生，從而激活下游信號通路，進而導致細胞死亡。研究者通過使用tMCAO動物模型和Trpm2基因型小鼠進行實驗，探討了TRPM2通道在缺血再灌注中的作用。實驗結果表明，注射膽紅素增加了患有tMCAO的Trpm2^+/+小鼠的梗死體積，而Trpm2^-/-小鼠的梗塞體積沒有改變。這表明缺血性損傷可能引起內源性膽紅素釋放，而TRPM2通道在其中發揮一定作用。研究者還觀察到血清和腦脊液中膽紅素水平與梗塞體積顯著相關，尤其是在Trpm2^+/+小鼠中。總體而言，研究得出結論，中風期間的缺血再灌注會導致膽紅素濃度增加，并且TRPM2通道可能在這一過程中發揮一定的調節作用。

2、膽紅素通過一種新的門控機制激活TRPM2通道

研究團隊討論了膽紅素及其結構衍生物對TRPM2通道的激活機制。先前的研究指出，內源性激動劑ADPR通過N端的MHR1/2和C端的NUDT9-H結構域與TRPM2通道的兩個部位結合，控制其開放。然而，由于膽紅素具有高度的膜通透性，研究者推測膽紅素可能通過不同的機制激活TRPM2通道。

通過在ADPR結合位和NUDT9-H結構域引入點突變，研究者發現這些突變體仍然對膽紅素產生反應，盡管激活幅度降低。與此相反，ADPR未能激發經過突變的TRPM2通道。進一步的實驗證實，截斷N端和C端的ADPR結合結構域會阻止ADPR對TRPM2的激活，但不影響膽紅素的激活。觀察到膽紅素及其衍生物對TRPM2通道的激活時間相對較長，而較小的分子如XAME激活通道的速度更快。通過分子對接模擬，研究者發現膽紅素可能與TRPM2通道的特定結合口袋發生相互作用。該口袋位于TRPM2通道的鈣結合部位附近，與D866、K928和D1069等氨基酸殘基形成氫鍵和鹽橋。

通過實驗證實，將這些殘基替換為非極性丙氨酸并不影響ADPR和鈣離子的激活，但阻止了膽紅素的激活。最終，通過分子動力學模擬，研究者比較了膽紅素和XAME在TRPM2通道復合體中的狀態轉變。結果表明，XAME的親和力高于膽紅素，這可能解釋了它們在激活速度和效果上的差異。總體而言，這項研究揭示了膽紅素激活TRPM2通道的機制，與經典的細胞內配體不同。

圖 膽紅素結合hTRPM2的特異性識別

3、TRPM2通道中的膽紅素結合腔是拮抗神經毒性的理想藥物部位

TRPM2是中風治療的靶點，使用不同結構的阻滯劑，如克霉唑、talM2NX和A23，在動物模型的臨床前研究中被認為具有神經保護作用。研究團隊發現新發表的TRPM2阻斷劑A23與腔形成了高度穩定的結合，為其體外納米分子半最大抑制濃度和體內抗缺血性損傷的有效性提供了結構解釋。A23與膽紅素結合腔高親和力，可有效拮抗膽紅素對神經毒性的作用。

隨后團隊研究了tMCAO聯合膽紅素注射對腦梗塞體積增加、血清和腦脊液膽紅素水平升高的影響，并探討了可能的機制。實驗結果表明，tMCAO聯合膽紅素注射可導致腦梗塞體積增加，血清和腦脊液膽紅素水平升高，且膽紅素主要在神經元中產生和釋放。實驗還發現，缺血和缺氧可直接誘導大腦釋放內源性膽紅素，從而加劇中風時的神經毒性。

圖 神經元NeuN、TRPM2通道、膽綠素還原酶BVR和血紅素加氧1(HO-1)的mIHC結果圖，表明在中風期間，膽紅素主要是在神經元中產生和釋放的

4、TRPM2上膽紅素結合腔的分子擾動消除膽紅素誘導的興奮性上調和神經毒性

研究團隊通過各項實驗，得出結論膽紅素及其結構相似的衍生物能通過與TRPM2通道附近的空腔結合來激活該通道，其中A23通過競爭性拮抗阻斷了這些激動劑的結合。為了驗證TRPM2上的空洞介導膽紅素神經毒性，研究使用基因敲入小鼠系，將TRPM2中的關鍵位點替換為丙氨酸。實驗證明這個位點對于膽紅素是有效的激動劑，而不是鈣/ADPR。D1066A小鼠在電生理實驗中顯示膽紅素不再誘導神經元的過度興奮，并在缺血性腦損傷模型中膽紅素的加重效應被抑制。這說明TRPM2通道中的結合腔對于膽紅素在中風中的神經毒性發揮了關鍵作用。

結語：

本研究為開發針對TRPM2通道中膽紅素結合腔的新策略提供了機械洞察力和原則證據，以減輕和預防患者與中風和黃疸相關的腦損傷。

參考文獻：

Liu HW, Gong LN, Lai K, Yu XF, Liu ZQ, Li MX, Yin XL, Liang M, Shi HS, Jiang LH, Yang W, Shi HB, Wang LY, Yin SK. Bilirubin gates the TRPM2 channel as a direct agonist to exacerbate ischemic brain damage. Neuron. 2023 May 17;111(10):1609-1625.e6. doi: 10.1016/j.neuron.2023.02.022. Epub 2023 Mar 14. PMID: 36921602; PMCID: PMC10191619.

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