食品安全的重要性不言而喻，而微生物檢測(cè)是食品安全檢驗(yàn)的重要組成部分。在進(jìn)行微生物檢測(cè)時(shí)，首先要根據(jù)其性質(zhì)和特點(diǎn)，選擇適合的微生物檢驗(yàn)方法，同時(shí)還要明確食品的污染狀況、危害程度以及具體的檢驗(yàn)項(xiàng)目和要求。

微生物檢測(cè)方法包括常規(guī)檢測(cè)法（如平板計(jì)數(shù)法、涂片鏡檢、分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)等）、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法、代謝學(xué)技術(shù)等。本期小愛(ài)向大家介紹2種常用的微生物檢測(cè)方法：平板計(jì)數(shù)法和流式檢測(cè)法。

1、平板計(jì)數(shù)法

微生物平板計(jì)數(shù)常用3種培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏 (Gause)Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基和Martin瓊脂培養(yǎng)基。針對(duì)食品微生物檢測(cè)常用培養(yǎng)基的配制，應(yīng)當(dāng)根據(jù)不同檢驗(yàn)?zāi)康模x擇不同的配制材料，常見(jiàn)的培養(yǎng)基材料配比如表1。在實(shí)際食品微生物檢驗(yàn)過(guò)程中，根據(jù)不同的需要對(duì)配制材料進(jìn)行選擇。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：主要用于食品微生物中細(xì)菌的培養(yǎng)。為保證培養(yǎng)基的質(zhì)量，需要在125℃環(huán)境下持續(xù)進(jìn)行15min的滅菌處理。

高氏 (Gause)Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基：主要用于放線菌的培養(yǎng)。在配制的過(guò)程中，首先應(yīng)當(dāng)在淀粉中添加少量的冷水，通過(guò)攪拌得到糊狀淀粉后，再將其倒入100℃的水中，然后加熱并加入其余配制材料攪拌至溶化。配制后同樣需要在125℃環(huán)境下持續(xù)進(jìn)行15min的滅菌處理。

Martin瓊脂培養(yǎng)基：主要用于微生物中真菌的分離，完成滅菌處理后，在使用前加入0.02%鏈霉素稀釋液，通常為100~150mL，保證每毫升培養(yǎng)基當(dāng)中均含有25μg鏈霉素。

表1  73種常用培養(yǎng)基材料配比^[1]

然而，平板計(jì)數(shù)法時(shí)效性不足、難以區(qū)分死活、無(wú)法檢測(cè)非培養(yǎng)性微生物。微生物活的非可培養(yǎng) (Viable but non-culturable，VBNC) 狀態(tài)（圖1）給平板計(jì)數(shù)法帶來(lái)了挑戰(zhàn)，同時(shí)也吸引了越來(lái)越多學(xué)者的關(guān)注。流式細(xì)胞術(shù)可解決平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)不到VBNC狀態(tài)菌的問(wèn)題。

圖1 VBNC狀態(tài)的形成與復(fù)蘇

2 、流式檢測(cè)法

微生物的流式細(xì)胞儀檢測(cè)也是科學(xué)研究中比較常用的檢測(cè)技術(shù)。與真核生物細(xì)胞相比，細(xì)菌等微生物的體積較小，其散射光難以與其他物質(zhì)的顆粒區(qū)分。因此，通過(guò)流式細(xì)胞儀的檢測(cè)依賴(lài)于與細(xì)胞結(jié)合的熒光染料，用于從背景中識(shí)別真正的目標(biāo)物。

A：液流系統(tǒng)；B：光源系統(tǒng)；C：檢測(cè)和計(jì)算、分析系統(tǒng)

圖2 流式細(xì)胞儀的組成及工作原理^[2]

根據(jù)熒光底物的不同，適用于流式檢測(cè)法的熒光染料主要包括：結(jié)合核酸的染料，如PI、7-AAD；標(biāo)記抗體蛋白的染料，如Cy5、FITC、PE。不同的熒光染料具有不同的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)。流式細(xì)胞儀通常會(huì)配備多個(gè)激光器，如405nm、488nm、633nm 等。多激光器可實(shí)現(xiàn)多熒光通道分析，減少自發(fā)熒光干擾、減少熒光信號(hào)之間的補(bǔ)償，提高檢測(cè)靈敏度。

表2 微生物流式檢測(cè)常用染料

另外，流式細(xì)胞術(shù)熒光標(biāo)記的選擇還需考慮儀器配置的光源波長(zhǎng)、染料的亮度與靶標(biāo)表達(dá)量的匹配、染料光譜重疊和樣本自發(fā)熒光等多重因素。

3、7-AAD流式檢測(cè)原理及方法

7-AAD是一種核酸染料，它在細(xì)胞凋亡和細(xì)胞死亡過(guò)程中會(huì)被釋放出來(lái)。當(dāng)細(xì)胞開(kāi)始凋亡時(shí)，其質(zhì)膜對(duì)7-AAD的通透性會(huì)逐漸增加。在特定的波長(zhǎng)激發(fā)下，7-AAD可以發(fā)出明亮的紅色熒光。通過(guò)這種熒光的強(qiáng)度，可以將細(xì)胞分為三個(gè)群體：7-AAD信號(hào)強(qiáng)的代表死亡細(xì)胞，7-AAD信號(hào)弱的則是處于凋亡狀態(tài)的細(xì)胞，而沒(méi)有檢測(cè)到7-AAD信號(hào)的是正常活力的細(xì)胞。

該操作步驟適用于大多數(shù)細(xì)胞，但不同的細(xì)胞類(lèi)型、細(xì)胞密度、使用的培養(yǎng)基以及其他一些因素都有可能影響染色效果以下步驟僅供參考。

1）儲(chǔ)存液的制備：取適量DMSO加入到7-AAD原瓶中配制成1-10mM儲(chǔ)存液，分裝保存于-20℃，可穩(wěn)定保存6個(gè)月；
2）根據(jù)自身樣本選擇合適的步驟固定細(xì)胞。7-AAD染色一般在其它染色完成后再進(jìn)行，且僅僅染色死細(xì)胞；
3）離心收集細(xì)胞，并用合適的的緩沖鹽溶液或者培養(yǎng)基（pH=7.4）重懸細(xì)胞；
注：貼壁細(xì)胞可在蓋玻片或者培養(yǎng)板上進(jìn)行原位染色。
4）加入適量7-AAD染色液，推薦該染料的工作濃度為0.5-5µM，孵育15-60min；
注：實(shí)驗(yàn)建議在推薦的工作濃度范圍內(nèi)設(shè)置濃度梯度檢測(cè)，從而摸索最佳的染色濃度。
5）根據(jù)其最大激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)（Ex/Em=545nm/650nm）在流式細(xì)胞儀下（FL3通道）檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

圖3 用0.25μg/10⁶ cells 7-AAD復(fù)染，流式檢測(cè)計(jì)算細(xì)胞死亡率^[3]

[1] 吳芳媛,馮秋芳,林黎.食品微生物檢驗(yàn)常用培養(yǎng)基配制,滅菌及貯藏研究[J].食品安全導(dǎo)刊, 2020(36):1.
[2] 高惠敏,顏春榮,徐春祥,等.食品微生物檢驗(yàn)中流式細(xì)胞術(shù)的研究進(jìn)展[J].生物災(zāi)害科學(xué), 2023, 46(4): 549-556.
[3] Tian X X, Nanding K, Dai X Y, et al. Pattern recognition receptor mediated innate immune response requires a Rif-dependent pathway[J]. Journal of Autoimmunity, 134 (2023) 102975.  影響因子：14.511

微生物培養(yǎng)基原料：

流式檢測(cè)常用染料：

流式檢測(cè)常用串聯(lián)染料：

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