概述

免疫細(xì)胞培養(yǎng)的六個(gè)基本流程：樣本制備、細(xì)胞分選、分型鑒定、擴(kuò)增&培養(yǎng)、質(zhì)量優(yōu)化、后續(xù)研究。小愛已經(jīng)給大家詳細(xì)介紹了《免疫細(xì)胞培養(yǎng)攻略之樣本制備（一）》、《免疫細(xì)胞培養(yǎng)攻略之細(xì)胞分選（二）》、《免疫細(xì)胞培養(yǎng)攻略之分型鑒定（三）》、《免疫細(xì)胞培養(yǎng)攻略之擴(kuò)增&培養(yǎng)（四）》今天我們繼續(xù)一起學(xué)習(xí)質(zhì)量優(yōu)化的相關(guān)知識(shí)。

質(zhì)量優(yōu)化(Quality Optimization)：針對(duì)一些不良因素，如樣本制備成單細(xì)胞懸液時(shí)產(chǎn)生的細(xì)胞團(tuán)塊、碎片等；細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)時(shí)支原體和內(nèi)毒素的影響，并積極采取對(duì)應(yīng)的措施。

質(zhì)量優(yōu)化

支原體(Mycoplasma)是介于細(xì)菌和病毒之間，沒有細(xì)胞壁的原核細(xì)胞型微生物。

1、形態(tài)特征

支原體的體積很小，0.1-0.3μm，光學(xué)顯微鏡無法觀測，也無法通過0.22μm的過濾器過濾，并且傳統(tǒng)的抗生素對(duì)支原體一般沒有效果。支原體可寄生/共生/獨(dú)立存活于培養(yǎng)基中，98%吸附于細(xì)胞膜或者細(xì)胞間隙。

2、污染源

1）支原體陽性細(xì)胞的交叉污染，并且由于支原體可垂直傳染，一旦細(xì)胞發(fā)生污染，下一代細(xì)胞同樣也會(huì)存在支原體的污染；

2）實(shí)驗(yàn)操作人員的口腔、唾液等等，實(shí)驗(yàn)人員的操作習(xí)慣，如交叉使用培養(yǎng)液、防護(hù)不到位也會(huì)成為支原體的污染來源；

3）培養(yǎng)條件如操作環(huán)境、培養(yǎng)用的儀器耗材清潔或滅菌不到位也都會(huì)增加支原體污染的風(fēng)險(xiǎn)。

3、對(duì)細(xì)胞研究的影響

1）抑制細(xì)胞生長、代謝，引起死亡：一般情況下輕度的支原體污染對(duì)于細(xì)胞的生長沒有明顯的影響，但是由于消耗培養(yǎng)液中的營養(yǎng)，所以細(xì)胞的生長會(huì)變慢，支原體也可能通過感染細(xì)胞并利用其生物合成機(jī)制，抑制關(guān)鍵代謝途徑，最終導(dǎo)致細(xì)胞生長受阻和死亡；

2）染色體畸變，破壞核酸合成，DNA片段化：支原體可能通過與細(xì)胞核酸相互作用，引發(fā)染色體結(jié)構(gòu)的變異，影響DNA合成和維持染色體完整性，如支原體感染可以模擬shRNA介導(dǎo)的p53敲除，允許Ras轉(zhuǎn)化，從而使p53的功能失活；

3）改變細(xì)胞膜抗原性：支原體影響參與炎癥和細(xì)胞轉(zhuǎn)化的細(xì)胞途徑，如支原體的蛋白質(zhì)與TLR相互作用或進(jìn)入細(xì)胞，從而改變負(fù)責(zé)炎癥和DNA修復(fù)的幾種途徑；

4）改變轉(zhuǎn)染效率：支原體可能通過影響細(xì)胞內(nèi)的基因轉(zhuǎn)運(yùn)和表達(dá)機(jī)制，減緩或干擾DNA的轉(zhuǎn)染效率；

5）對(duì)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑敏感性增加：支原體可以通過某些蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡途徑中的關(guān)鍵分子，增加細(xì)胞對(duì)凋亡誘導(dǎo)劑的敏感性，如NAE和支原體酶MGA-0676的相互作用，誘導(dǎo)的DF-1細(xì)胞凋亡。

4、支原體的預(yù)防

支原體的污染防治也是很重要的，比如：日常1-2周進(jìn)行支原體的檢測，對(duì)于新到的細(xì)胞株、凍存保種前、重要實(shí)驗(yàn)開始前都應(yīng)當(dāng)進(jìn)行支原體的檢測。10個(gè)預(yù)防支原體的tips大家可以保存學(xué)習(xí)噢：

1）穿戴適當(dāng)?shù)膫€(gè)人防護(hù)設(shè)備（手套、專用的干凈實(shí)驗(yàn)服、護(hù)目鏡）并消毒手套；

2）在細(xì)胞處理開始前以及處理不同細(xì)胞系之間擦拭安全柜中的工作桌面；

3）避免在你的細(xì)胞上說話或打噴嚏；

4）避免飛濺、溢出和氣溶膠；

5）為每個(gè)細(xì)胞系使用對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基瓶；

6）定期清潔培養(yǎng)箱，包括水盤；

7）定期清空及清潔水浴設(shè)備；

8）細(xì)胞復(fù)蘇幾天后測試新細(xì)胞培養(yǎng)物的支原體污染；

9）隔離所有進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室的細(xì)胞培養(yǎng)物,直到它們經(jīng)過支原體檢測；

10）不要忘記，每2周進(jìn)行一次支原體的常規(guī)檢測。

表1 預(yù)防支原體污染的試劑

5、支原體的檢測方法

支原體的檢測方法也非常多，小愛也給大家整理了每種方法的原理、優(yōu)缺點(diǎn)（下表）。

表2 支原體檢測方法的比較

表3 支原體檢測試劑盒

6、支原體的去除

目前相對(duì)有效的支原體的清除方法是使用支原體清除劑，其他的方法比如清洗純化法（利用離心力、細(xì)胞、微生物質(zhì)量和懸液的浮力差達(dá)到清除支原體的目的）或者使用支原體特異血清也可以嘗試。

表4 支原體去除試劑

內(nèi)毒素

內(nèi)毒素(endotoxin)是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的一種成分，其化學(xué)本質(zhì)是一種脂多糖(LPS)，其單位為EU/mg或EU/U。一個(gè)EU相當(dāng)于約0.1至0.2ng內(nèi)毒素/mL溶液。內(nèi)毒素只有當(dāng)細(xì)菌死亡溶解或用人工方法破壞后才釋放出來。

1、特征

內(nèi)毒素非常耐熱，只有在160℃，加熱2-4h，或者用強(qiáng)堿/強(qiáng)酸/強(qiáng)氧化劑加熱煮沸30min才能破壞其生物活性。

2、污染源

1）配制各種試劑、緩沖液的水；

2）各種培養(yǎng)基、血清和添加劑中“混入"；

3）塑料器具、玻璃器具等表面。

3、對(duì)細(xì)胞的影響

1）細(xì)胞功能改變：內(nèi)毒素可以刺激一些細(xì)胞分泌炎癥因子，導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)，如低至0.5ng/mL的內(nèi)毒素處理6h就可以增加馬腹膜巨噬細(xì)胞中IL-6的分泌；

2）導(dǎo)致細(xì)胞亞健康： 內(nèi)毒素會(huì)加速細(xì)胞衰老、凋亡，甚至死亡；

3）活化細(xì)胞：在單核細(xì)胞存在的條件下，100ng/mL內(nèi)毒素可以刺激人類T細(xì)胞的增殖及其淋巴因子的產(chǎn)生；

4）降低真核細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效率：已純化質(zhì)粒DNA中的內(nèi)毒素可降低所有細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效率和活力，內(nèi)毒素含量(>10EU/μg)會(huì)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)染、蛋白質(zhì)表達(dá)和活力產(chǎn)生負(fù)面影響。

4、內(nèi)毒素的預(yù)防

1）選擇高質(zhì)量/低內(nèi)毒素的培養(yǎng)基、血清和試劑耗材，在免疫細(xì)胞的培養(yǎng)過程中，可以選擇免疫細(xì)胞專用的無血清培養(yǎng)基，如果選擇經(jīng)典的培養(yǎng)體系，要選擇低內(nèi)毒素的血清和基礎(chǔ)培養(yǎng)基；同時(shí)，免疫細(xì)胞培養(yǎng)的過程中添加的生長因子等也要選擇高質(zhì)量低內(nèi)毒素的；

2）重復(fù)使用的實(shí)驗(yàn)耗材可高溫高壓處理：250℃，30min，或者180℃，3h；

3）細(xì)胞培養(yǎng)的水質(zhì)也至關(guān)重要，無酶無菌水(abs9259)可以滿足實(shí)驗(yàn)室每日15mL純水/超純水的用量，關(guān)愛每一個(gè)細(xì)胞寶寶；

4）另外可以對(duì)培養(yǎng)過程中自行配置的一些緩沖液進(jìn)行過濾除菌，這樣可以在加入到細(xì)胞之前消除潛在的內(nèi)毒素。

表5 預(yù)防內(nèi)毒素的相關(guān)產(chǎn)品

5、內(nèi)毒素的檢測

小愛也給大家整理了內(nèi)毒素每種檢測方法的原理、優(yōu)缺點(diǎn)（表6）。常用的方法是鱟試劑法和重組C因子法，由于鱟作為國家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物，目前不能再進(jìn)行大規(guī)模使用。所以我們推薦大家使用重組C因子(rFC)法來檢測內(nèi)毒素。

表6  內(nèi)毒素的檢測方法

6、內(nèi)毒素的清除

細(xì)胞培養(yǎng)中的內(nèi)毒素暫時(shí)沒有方法可以有效去除，所以小愛建議大家做好預(yù)防，畢竟防大于治！

今天講解就到這了，下一個(gè)質(zhì)量優(yōu)化，我們不見不散呀！大家如有細(xì)胞培養(yǎng)問題，歡迎一起交流哦！

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