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細胞治療邁向真正藥物化，In Vivo CAR-T全流程解析

閱讀：836 發布時間：2025-12-16

摘要

CAR-T 技術正從傳統方式的“體外（ex vivo）編程"快速擴展到“體內（in vivo）直接編程"。前者已在血液腫瘤中確立療效與標準流程，但存在制造復雜、成本高、可及性受限等瓶頸；后者責依托定向病毒載體或納米遞送核酸（mRNA/DNA）直接在患者體內改造免疫細胞，有望顯著簡化流程、降低成本并改善安全性與生物學特性。本文基于前沿綜述與實踐進展，系統梳理兩條技術路線、關鍵環節、核心差異及應用場景，供研發與轉化團隊參考。

一、什么是CAR-T細胞治療？

CAR?T細胞療法是指將患者外周血T細胞在體外（ex vivo）通過基因工程改造，使其表達能夠特異識別腫瘤相關抗原的嵌合抗原受體（CAR），經體外激活與擴增后回輸體內，從而定向清除腫瘤細胞的一種治療策略。

自2017年CAR?T產品獲批以來，CAR?T市場持續快速擴張：2024年上半年銷售額達到20.14億美元，預計到2030年市場規模將增至218億美元。

圖1

CAR-T技術自誕生以來，也經歷了數次迭代升級。CAR 結構從一代到第五代的演變過程如下。所有五代 CAR 結構均包含四個共同結構域，分別是胞外抗原結合結構域、鉸鏈區、跨膜區和胞內信號傳導結構域。

CAR結構的演變.[1]

其功能區別如下表所示：

代次	核心結構特征	功能優勢
一代（1st）	僅含 1 個 CD3ζ 信號分子，無共刺激結構域	可實現基礎的抗原識別與 T 細胞激活，結構較簡單
第二代（2nd）	CD3ζ 信號分子 + 1 個共刺激結構域（CD28 或 4-1BB）	增強 T 細胞活化信號，提升 T 細胞增殖能力與存活時間
第三代（3rd）	CD3ζ 信號分子 + 2 個不同共刺激結構域（CD28-4-1BB 或 ICOS-4-1BB）	進一步強化信號傳導，相比第二代更能增強 T 細胞的殺傷活性與持續性
第四代（4th）	含 CD3ζ、共刺激結構域 + 編碼細胞因子（如 IL-12、IL-15）的基因序列	激活后可釋放免疫刺激性細胞因子，提高 T 細胞在腫瘤組織中的浸潤能力
第五代（5th）	含 TCR 激活信號、共刺激信號、細胞因子信號三個關鍵結構域（通用型 CAR）	實現接近生理狀態的細胞因子信號傳導，全面增強 T 細胞功能

二、Ex vivo和In vivo CAR-T路線的全流程梳理

1. 傳統體外 CART（ex vivo）

患者篩選與轉診 → 白細胞分離（leukapheresis）→ T 細胞激活（CD3/CD28、細胞因子）→ 基因轉導（常用慢病毒/γ逆轉錄病毒，或非病毒方法）→ 體外擴增與質控放行 → 回輸前淋巴清除（環磷酰胺/氟達拉濱）→ 回輸與監測

痛點與瓶頸

制造復雜、時間長（2–7周“靜脈到靜脈"周期），快速進展患者常需橋接治療
個體化產品導致批間差異、產率波動及成本高昂
淋巴清除帶來長期免疫細胞減少與感染風險
全流程對GMP產能、冷鏈與多點協同要求很高

2. 體內 CART（in vivo）

單一“即用型"制劑直接給藥給患者，以體內存在的免疫細胞為基礎，完成CAR 基因的在體導入與表達，形成活性CAR 細胞群

主要實現路徑

ⅰ. 定向病毒載體：工程化慢病毒/逆轉錄病毒或 AAV，通過偽型化包膜/衣殼與外接靶向配體（scFv、納米抗體、DARPin 等），在體內優先轉導 T 細胞（CD3/CD4/CD8 等）
ⅱ. 非病毒納米遞送：脂質納米顆粒（LNP）或可降解聚合物納米顆粒（PBAE 等）遞送 mRNA 或 DNA；并可通過抗體偶聯（如抗 CD3/CD4/CD5/CD8）或脂質組成調控，增強對 T 細胞的攝取與表達

關鍵特征

ⅰ. 批量化、標準化“單一產品"，可儲備并快速可及
ⅱ. 理論上可不依賴（或弱依賴）淋巴清除，保留完整免疫網絡促進表位擴展
ⅲ. mRNA 方案多為短暫表達，可“可編程多次給藥/劑量調控"，兼顧療效與安全

體外及體內CAR-T治療流程示意圖[1]

三、In vivo CAR-T關鍵技術要點

1. 載體/遞送系統與靶向策略

病毒載體

慢病毒：偽型化（如VSVG、麻疹、尼帕、辛德畢斯、cocal等）+ T 細胞靶向配體（antiCD3/CD4/CD8 的 scFv/DARPin），實現特異轉導與膜融合進入；整合表達支持長期持續
AAV：衣殼表面展示靶向配體；以非整合表觀遺傳存在提供中長程表達

非病毒納米遞送

LNP：離子化陽離子脂質+輔脂（磷脂/膽固醇/PEG脂質）；通過內吞內體逃逸釋放mRNA；可額外偶聯抗體以增強 T 細胞攝取
聚合物納米顆粒：可攜帶 mRNA 或 DNA；可通過多肽/抗體裝飾提高特異性；可與轉座子系統合用以實現持久表達（需格外注意安全性）
外泌體：工程化外泌體（例如樹突狀細胞來源外泌體），表面修飾抗 CD3/EGFR 抗體

遞送載體

2. 核酸構建與表達動力學

mRNA 設計：加帽、優化UTR（常見α/βglobin 5′/3′UTR）、N1甲基偽尿苷修飾、Poly(A)長度等，綜合提高穩定性與翻譯效率并降低先天免疫識別
協同遞送：可與siRNA（如PD1 siRNA）共遞送以同步解除免疫抑制
表達時程：mRNALNP通常為短暫表達（數日級），適于“可重復給藥 → 劑量/毒性實時調控 → 避免過度持續刺激引起衰竭"；DNA/整合型方案可延長表達，但插入突變與脫靶細胞轉導風險需評估

3. 特異性與安全

脫靶轉導/轉染的后果

腫瘤細胞被轉導可發生“表位遮蔽"（cis 結合導致抗原不可及）
抑制性免疫細胞（如Treg）被轉導可能加劇疾病
生殖細胞/干細胞轉導（病毒整合）存在生殖系/致癌風險

免疫原性與重復給藥

LNP脂質本身的免疫刺激性、補體相關反應需管理（可借鑒已上市LNPsiRNA的預處理方案）
AAV/偽型包膜的既往免疫與中和抗體影響
mRNALNP的多次給藥策略與免疫反應平衡

4. 工藝與劑量

給藥途徑：靜脈優先；部分適應癥考慮局部/腔內給藥以提高局部暴露
劑量暴露應答關系：mRNA負載、LNP配方（脂質比例/粒徑/表面化學）、UTR選擇、靶向配體密度等共同決定體內T細胞陽轉比例與表達持續時間
組合策略：多靶點并行（多mRNA或多載體序貫）、可誘導因子/合成細胞因子受體共表達等

不同載體遞送方式優缺點比較

四、體外與體內 CART 的差異與優缺點

研發/生產模式

體外：個體化定制，流程復雜、周期長、成本高但可嚴控產品屬性
體內：單一批量化制劑，制造和放行流程大幅簡化，快速可及、可及性強

免疫學與生物學

體外：需淋巴清除以促嵌合與擴增；體外擴增可能降低干性并誘導衰竭
體內：保留完整免疫微環境，利于表位擴展；mRNA短暫表達+分次給藥可減輕持續刺激、降低CRS/ICANS風險并實現“劑量到效"

表達持久性

體外：整合型載體+擴增→長期持續
體內：mRNA 需重復給藥；整合型病毒可長期，但對嚴格特異性和基因組安全提出更高要求

安全性側重

體外：制品內源性/外源性突變克隆擴增監測、插入位點分析
體內：額外關注非靶細胞/生殖細胞轉導、腫瘤細胞表位遮蔽、系統性免疫反應/過敏

適應癥與場景

體外：已在 B 細胞惡性腫瘤中成熟
體內：對需要廣覆蓋與快速可及的疾病（如自身免疫、感染、纖維化）尤具吸引力；在腫瘤學中可作為快速橋接或與體外產品互補

五、應用版圖與策略建議

血液腫瘤：體內整合型病毒或多次 mRNA 給藥，取決于病情復發風險與需要的清除深度
自身免疫病：CD19/BCMA 等 B 細胞清除策略；mRNALNP更利于“低毒+可重復可調"的長期管理
感染疾病（如HIV、HBV研究中）：大規模可及、避免淋巴清除免疫低下的優勢突出
纖維化/組織修復：短暫FAPCAR等在局灶組織內牽引免疫清除，配合心衰/肝纖維化等疾病早期干預

六、轉化與監管關注要點

病毒載體：特異性轉導證明、插入位點/克隆擴增長期隨訪、生殖系風險隔離
非病毒：配方一致性、mRNA質量與殘留雙鏈RNA控制、免疫安全評估與重復給藥策略
CMC：放大工藝、批次一致性、冷鏈與可及性；體內制劑的質量屬性（粒徑/電荷/包封率/靶向偶聯穩定性）需量化
伴隨診斷：循環/組織中CAR細胞動力學、B細胞/腫瘤負荷監測、生物標志物（炎癥細胞因子、神經毒性風險指標）

七、愛必信相關產品與服務

1. mRNA合成產品

貨號	產品名稱	規格
abs60690	T7 高產率RNA共轉錄試劑盒 (N1-Me-pUTP)	50T
abs60152	牛痘病毒加帽酶	500U/2000U/10000U
abs60153	T7 RNA 聚合酶	100KU/250KU
abs60166	2 氧甲基轉移酶	2500U/10000U/50000U
abs60539	脫氧核糖核酸酶 I	1KU/5KU
abs60150	RNA酶抑制劑	250ul/1mL

mRNA定制服務

客戶提供CDS序列 → 基因合成/質粒改造 → 模板制備線性化 → 體外轉錄 → 產物回收，質控交付

mRNA定制服務流程示意圖

服務參數：

標準定制加帽方式：化學共轉錄法
標準定制帽結構：AbsCap AG
標準定制修飾堿基：N1-methyl-Pseudouridine-5'-Triphosphate
標準定制 UTR: Abs-CBT
合成量：100ug起
標準質控：RNA完整性檢測，RNA純度膠圖
標準定制合成周期：2-4周

注：（1）定制化合成需客戶提供CDS區的序列，交付終點為制備RNA。

（2）本定制化合成的UTR經過數百條序列驗證，推薦使用，但不能保證RNA表達。

（3）圖示中的signal peptide區僅為有分泌型的客戶提示，如有分泌型需求，請提供信號肽序列。

2. 遞送效率驗證

工具mRNA+體外外轉染試劑

貨號	產品名稱	規格
abs60339	mRNA轉染試劑	1mL
abs60620	easyLNP™ mRNA免疫細胞轉染試劑盒	1.5mL/3mL/5mL
abs60621	easyLNP™ Plus 通用型RNA細胞轉染試劑盒	1.5mL/3mL/5mL
abs60622	easyLNP™ mRNA體內轉染試劑盒（全身作用）	0.3mL/0.5mL/1mL
abs60623	easyLNP™ mRNA體內轉染試劑盒（局部作用）	0.3mL/0.5mL/1mL
abs60174-A	Cas9 mRNA(N1-Methylpseudo-UTP)	100ug/100ug×5/100ug×10
abs60176-A	EGFP mRNA(N1-Methylpseudo-UTP)	100ug/100ug×5/100ug×10
abs60178-A	Fluc mRNA(N1-Methylpseudo-UTP)	100ug/100ug×5/100ug×10
abs60180-A	mcherry mRNA(N1-Methylpseudo-UTP)	100ug/100ug×5/100ug×10
abs60191-A	Cre mRNA(N1-Methylpseudo-UTP)	100ug/100ug×5/100ug×10
abs60312-A	OVA mRNA(N1-Methylpseudo-UTP)	100ug/100ug×5/100ug×10
abs60333	Endless Fluc mRNA	100ug
abs60332	Endless eGFP mRNA	100ug

3. 體內驗證

貨號	產品名稱	規格	產品特點
abs42017259	D-熒光素鈉鹽	100mg/1g	體內轉到效率及分布驗證
abs42075819	D-熒光素鉀鹽	25mg/100mg/1g	體內轉到效率及分布驗證

4. 質控

病毒質控

貨號	品名	規格	特點
abs590005	CHO細胞 HCP殘留檢測試劑盒	96T	檢測CHO K1細胞HCP，高覆蓋率抗體，特異性強，靈敏度高，檢測下限低至3ng/ml
abs590016	E.coli表達菌HCP殘留檢測試劑盒	96T	檢測E.coli BL21菌株HCP，高覆蓋率抗體，特異性強，靈敏度高，檢測下限低至1ng/ml
abs60544	宿主細胞殘留DNA（磁珠法）樣本前處理試劑盒	100T	通用性好(可提取多種HCD），方便快捷(支持手動&自動，1h完成)
abs60543	質粒DNA殘留(qPCR)檢測試劑盒	100T	搭配宿主細胞殘留DNA樣本前處理試劑盒使用；靈敏度高，線性范圍300pg/µL~0.03pg/µL；精密度高：低濃度重復性CV值<20%；中高濃度重復性CV值<15%；線性標準：依據國標的基本要求，各項指標全，標準高，結果穩定可靠；快速高效：檢測快速，一小時即可出結果
abs60545	HEK293殘留DNA（qPCR）檢測試劑盒	100T
abs60546	293T細胞殘留DNA（qPCR）檢測試劑盒	100T
abs60547	Human殘留DNA（qPCR）檢測試劑盒	100T
abs60548	Hela細胞殘留DNA（qPCR）檢測試劑盒	100T
abs60549	E1A殘留DNA（qPCR）檢測試劑盒	100T
abs60550	E1A&SV40LTA殘留DNA(qPCR)檢測試劑盒	100T
abs60551	E.coli殘留DNA（qPCR）檢測試劑盒	100T
abs60552	E.coli總RNA殘留（qPCR）檢測試劑盒	100T
abs60553	CHO殘留DNA（qPCR）檢測試劑盒	100T
abs60554	Vero殘留DNA（qPCR）檢測試劑盒	100T
abs60555	畢赤酵母殘留DNA（qPCR）檢測試劑盒	100T
abs60556	PG13殘留DNA（qPCR）檢測試劑盒	100T
abs60557	HEK293殘留DNA片段（qPCR）檢測試劑盒	100T
abs60558	293T細胞殘留DNA片段（qPCR）檢測試劑盒	100T
abs60559	Human殘留DNA片段（qPCR）檢測試劑盒	100T
abs60560	Hela細胞殘留DNA片段（qPCR）檢測試劑盒	100T
abs60561	Vero殘留DNA片段（qPCR）檢測試劑盒	100T

mRNA質控

貨號	品名	規格	特點
abs590008	BSA殘留檢測試劑盒	96T	特異性強，不與其他種屬反應；靈敏度高，可檢測＜0.5ng/mL；準確性高，重復性好
abs590010	卡那霉素殘留檢測試劑盒	96T	靈敏度高，可檢測＜0.05 ng/mL，準確性高，重復性好，兩步競爭法，1h出結果方便快捷
abs590011	慶大霉素殘留檢測試劑盒	96T	靈敏度高，可檢測＜0.05 ng/mL，準確性高，重復性好，兩步競爭法，1h出結果方便快捷
abs590009	Protein A殘留檢測試劑盒	96T	靈敏度高，不懼高濃度IgG干擾
abs520031	RNase Inhibitor ELISA Kit	96T	夾心法ELISA，靈敏度高，重復性好（mRNA生產）
abs590015	T7 RNA聚合酶殘留檢測試劑盒（ELISA法）	96T	夾心法ELISA，靈敏度高，重復性好（mRNA生產）

污染物質控

貨號	品名	規格	特點
abs9925	支原體檢測試劑盒（qPCR法）	50T	檢出率高：10CFU/mL口腔支原體、豬鼻支原體、肺炎支原體等各國藥典提及的10種支原體標準菌株的檢出率為100%。無假陽性，重復性好，CV值低于5%。
abs90283	MYCO-L™熒光素酶支原體檢測試劑盒	10-50T	檢測范圍廣，靈敏度與qPCR法相當，檢測快速，30min可出結果
abs500001	重組 C 因子內毒素檢測試劑盒	48T/96T	重組C因子替代傳統鱟試劑，檢測下限低至0.005EU/ml，藥典方法

細胞因子質控

貨號	品名	規格	特點
abs590014	dsRNA ELISA Kit	96T	特異性檢測60bp以上dsRNA，與序列無關；支持多種修飾堿基dsRNA檢測；靈敏度高，重復性好
abs560022	Human IL-2 Kit (HICA)	500-10000T	均相化學發光技術，免洗均相檢測，化學發光，超寬線性范圍，高靈敏度，快速
abs510028	Human IL-7 ELISA Kit	96T	傳統夾心法ELISA，經典檢測方法
abs510018	Human IL-15 ELISA Kit	96T	傳統夾心法ELISA，經典檢測方法
abs551810	Human IL-21 High Sensitivity ELISA Kit	96T	高敏ELISA，TSA信號放大，檢測下限更低
abs50186	人十二項細胞因子檢測試劑盒（流式熒光發光法）	48T/96T	CBA流式多因子檢測，一份樣本檢測12個指標

流式功能驗證質控

貨號	產品名稱	用途
abs930	人淋巴細胞分離液	PBMC收集
abs9518	大小鼠外周血淋巴細胞分離液
abs9101	紅細胞裂解液（1×）
abs9475	固定劑	流式染色輔助試劑
abs9110	細胞染色緩沖液
abs9111	破膜劑

細胞治療相關指標檢測

貨號	產品名稱	具體作用	應用分類
abs510007	Human IFN-γ ELISA Kit	細胞免疫主導，抗胞內病原體與腫瘤。	Th1型反應標志(細胞免疫主導，抗胞內病原體/腫瘤)
abs551162	Human IL-12 ELISA Kit	促進 Th1 細胞分化，增強細胞免疫功能，抗胞內病原體與腫瘤。
abs510012	Human IL-12p70 ELISA Kit	促進 Th1 細胞分化，增強細胞免疫功能，抗胞內病原體與腫瘤。
abs510004	Human IL-8/CXCL8 ELISA Kit	協同 IL-12 增強 NK 細胞功能，促進 Th1 細胞分化，參與細胞免疫反應。
abs551124	Human IL-18 ELISA Kit	協同 IL-12 增強 NK 細胞功能，促進 Th1 細胞分化，參與細胞免疫反應。
abs5510734	Human CXCL9/MIG ELISA Kit	趨化免疫細胞，參與 Th1 型免疫應答，抗胞內病原體與腫瘤。
abs510027	Human CXCL10/IP-10 ELISA Kit	趨化免疫細胞，參與 Th1 型免疫應答，抗胞內病原體與腫瘤。
abs551855	Human TNF-b ELISA Kit	調節免疫細胞功能，參與細胞免疫反應，抗胞內病原體與腫瘤。
abs560032	Human IFN-γ Kit (HICA)	細胞免疫主導，抗胞內病原體與腫瘤。
abs560029	Human IL-12p70 Kit (HICA)	促進 Th1 細胞分化，增強細胞免疫功能，抗胞內病原體與腫瘤。
abs560026	Human IL-8 Kit (HICA)	協同 IL-12 增強 NK 細胞功能，促進 Th1 細胞分化，參與細胞免疫反應。
abs560036	Human TNF-β Kit (HICA)	調節免疫細胞功能，參與細胞免疫反應，抗胞內病原體與腫瘤。
abs510017	Human IL-4 ELISA Kit	體液免疫主導，抗寄生蟲，介導過敏反應。	Th2型反應標志(體液免疫主導，抗寄生蟲，過敏反應)
abs551003	Human IL-5 ELISA Kit	促進嗜酸性粒細胞增殖與分化，參與抗寄生蟲免疫和過敏反應。
abs551004	Human IL-9 ELISA Kit	參與 Th2 細胞介導的免疫反應，如過敏反應。
abs510016	Human IL-13 ELISA Kit	調節體液免疫，參與抗寄生蟲免疫和過敏反應。
abs560024	Human IL-5 Kit (HICA)	促進嗜酸性粒細胞增殖與分化，參與抗寄生蟲免疫和過敏反應。
abs510003	Human IL-6 ELISA Kit	抗胞外菌 / 真菌，參與自身免疫和炎癥反應。	Th17型反應標志(抗胞外菌/真菌，參與自身免疫/炎癥)
abs510019	Human IL-17/IL-17A ELISA Kit	招募中性粒細胞，抗胞外病原體，參與炎癥和自身免疫疾病。
abs510020	Human IL-22 ELISA Kit	維持上皮屏障功能，抗胞外病原體，參與炎癥反應。
abs510013	Human IL-23 ELISA Kit	維持 Th17 細胞穩定性，參與炎癥和自身免疫反應。
abs560025	Human IL-6 Kit (HICA)	抗胞外菌 / 真菌，參與自身免疫和炎癥反應。
abs510005	Human IL-10 ELISA Kit	維持免疫耐受，抑制免疫反應。	調節性T細胞 (Treg) 反應標志(維持免疫耐受，抑制免疫反應)
abs510032	Human TGF-β1 ELISA Kit	調節免疫細胞功能，抑制免疫反應，維持免疫穩態。
abs5510126	Human FOXP3 ELISA Kit	Treg 細胞特異性標志物，評估 Treg 細胞數量與功能。
abs551193	Human LAG3 ELISA Kit	參與免疫抑制，調節 T 細胞活化，維持免疫耐受。
abs5510648	Human sCTLA-4 ELISA Kit
abs5510649	Human CTLA4 ELISA Kit
abs560027	Human IL-10 Kit (HICA)	維持免疫耐受，抑制免疫反應。

參考文獻：
1. Huang Y, Cao R, Wang S, Chen X, Ping Y, Zhang Y. In vivo CAR-T cell therapy: New breakthroughs for cell-based tumor immunotherapy. Hum Vaccin Immunother. 2025 Dec;21(1):2558403. doi: 10.1080/21645515.2025.2558403.

好消息！Absin文獻獎勵重磅升級！

Absin產品線：

爆款產品：試劑盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化檢測、殘留檢測、多因子檢測)；細胞培養(類器官試劑盒+基質膠，胎牛血清+培養添加劑+細胞因子)、分化試劑盒；分子(mRNA合成服務+提取試劑盒)；化合物大包裝；輔助試劑、耗材/儀器、定制服務(抗體/多肽/蛋白/標記/檢測)...

特色產品：雞胚提取物CEE、B27、N2、霍亂毒素B亞單位CTB、牛腦垂體提取物BPE、百日咳毒素PTX、重組人胰島素Insulin、人源低密度脂蛋白LDL...

細胞治療邁向真正藥物化，In Vivo CAR-T全流程解析

摘要

一、什么是CAR-T細胞治療？

二、Ex vivo和In vivo CAR-T路線的全流程梳理

1. 傳統體外 CART（ex vivo）

痛點與瓶頸

2. 體內 CART（in vivo）

主要實現路徑

關鍵特征

三、In vivo CAR-T關鍵技術要點

1. 載體/遞送系統與靶向策略

病毒載體

非病毒納米遞送

2. 核酸構建與表達動力學

3. 特異性與安全

脫靶轉導/轉染的后果

免疫原性與重復給藥

4. 工藝與劑量

四、體外與體內 CART 的差異與優缺點

研發/生產模式

免疫學與生物學

表達持久性

安全性側重

適應癥與場景

五、應用版圖與策略建議

六、轉化與監管關注要點

七、愛必信相關產品與服務

1. mRNA合成產品

mRNA定制服務

服務參數：

2. 遞送效率驗證

3. 體內驗證

4. 質控

病毒質控

mRNA質控

污染物質控

細胞因子質控

流式功能驗證質控

細胞治療相關指標檢測

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