在分子生物學實驗室里，RNA表達分析堪稱“基礎中的基礎"，從基因功能驗證到疾病標志物篩選，幾乎都離不開它的身影。但不少科研人都曾踩過坑：提的RNA降解嚴重、逆轉錄效率忽高忽低、熒光定量結果重復性差……其實，搞定這些問題的關鍵，就藏在TriiZol裂解提取、逆轉錄合成cDNA、熒光定量PCR（qPCR）檢測這“三件套"里。今天就帶大家吃透這套黃金組合的操作精髓，讓你的RNA表達研究一路綠燈！

di一關：TriiZol法提取RNA——守住實驗的“源頭活水"

RNA天生“嬌弱"，易被核酸酶降解，而TriiZol試劑憑借*的裂解能力和核酸酶抑制效果，成為提取總RNA的“王pai選手"。無論是動物組織、植物樣本還是細胞，它都能輕松應對，幫你拿到高質量RNA。

TriiZol（abs60154）標準操作PROTOCOL

1. 樣本處理

組織樣本：

TriiZol用量：每 50-100 mg 組織加 1 ml TriiZol，樣品體積不應超過TriiZol體積的10％。

（1）將動物或植物組織切成小塊，在液氮中磨碎或用勻漿器勻漿處理。

（2）將研磨好的組織粉末快速轉入裝有1 ml TriiZol 的 2 ml 離心管中，在渦旋振蕩器上迅速振蕩混勻，置于冰上，待所有的樣品研磨完。

（3）裂解產物應呈澄清的透明粘稠液體。對于富含蛋白、脂肪或多糖物質的組織樣品如肌肉、脂肪組織和植物結節部位等，勻漿后仍會存留有不溶物質，可于 4℃ 12,000 x g 離心 10 min，然后吸取上清至一新的離心管中。

 細胞樣本：

（1）貼壁細胞：吸盡培養液，每 10 cm²培養面積（6 孔板單孔或 35 mm 平皿）加入 1 ml TriiZol，用加樣器吹打數次，以確保細胞wan全裂解，然后轉移至離心管中。

注：TriiZol 的使用量應由培養皿表面積決定，而非由細胞數目決定。TriiZol量不足可能導致提取的RNA中有DNA污染 。

（2）懸浮細胞：離心收集細胞，吸盡液體，每5-10×10⁶動植物或酵母細胞，或每1×10⁷細菌細胞加入1ml TriiZol，用加樣器吹打，使其wan全裂解，然后轉移至離心管中。

 注：添加 TriiZol 前切勿洗滌細胞，以免 RNA 降解。必要時可以用勻漿器來裂解某些細菌或者酵母細胞。

2．液相分離

（1）裂解產物于室溫放置5 min，使核酸-蛋白復合物wan全分離。（注：此時樣品可在-80℃長期保存。）

（2）每 1 ml TriiZol 加入 0.2 ml 氯仿，蓋緊管蓋，劇烈振蕩 15 s，室溫放置 2-3 min。

（3）4℃ 12,000 × g 離心 15 min，樣品會分成三層：桔黃色的下層有機相(蛋白)，中間層（DNA）和無色的上層水相。

（4）吸取含總RNA 的上層水相至一新的離心管中，吸取水相的體積為所用TriiZol試劑的 60％。

注：轉移水相時切勿觸及中間層，否則可能導致基因組DNA污染

3． RNA 回收

（1）按照每 1 ml TriiZol 的最初使用量加入0.5 mL 異丙醇，顛倒數次混勻，室溫放置10 min。

（2）4℃ 12,000 × g 離心 10 min，棄除上清，可見膠狀的RNA沉淀。

（3）按照每 1 ml TriiZol 的最初使用量加入1 ml 75%乙醇，顛倒數次混勻，洗滌沉淀。

（4）4℃ 12,000 × g 離心 5 min，棄除上清。

（5）室溫倒置5-10 min 晾干或真空抽干（不要使用真空干燥離心機，以免RNA過干，難以溶解）。

（6）加入適量（如 25ul）DEPC-ddH₂O 或TE緩沖液，用加樣器吹打數次溶解 RNA。

（7）通過 RNA 電泳以及紫外分光光度計檢測，確定 RNA 的濃度、純度和完整性。

（8）所得的 RNA 應立即使用或適量分裝后-80℃保存，避免反復凍融。

注意事項：

1、如果需要測量 RNA 的 A260/A280 的比值，建議使用RNA定量緩沖液對樣品稀釋后，進行測量。

2、所有離心管，槍頭及相關溶液都必須無 RNA酶污染。耐高溫器物可 180℃烘烤 4 小時以去除RNA 酶，其它器物去除 RNA 酶可考慮用 0.01%的 DEPC 水浸泡過夜，然后滅菌，烘干。溶液需用 DEPC 水配制。加 0.01% DEPC 至重蒸水或 MiliQ 級水中，處理過夜，滅菌即成 DEPC 水。

3、使用凍存的細胞或組織抽提總 RNA 的效果通常比新鮮的細胞或組織差一些。因為在細胞或組織凍融過程中一些細胞或組織內的 RNase 會被釋放出來并剪切樣品。如果不能及時抽 RNA， 推薦先加入適量 TriiZol，并裂解樣品后凍存。

4、必須戴一次性手套操作，且盡量不要對著 RNA 樣品呼氣或說話，以防 RNA 酶污染。建議戴一次性口罩操作。

5、TriiZol 含有毒物質苯酚，避免接觸皮膚或吸入。為防止濺入眼睛，請戴防護眼鏡或使用透明保護屏。如皮膚接觸 TriiZol，請立即用大量去垢劑和水沖洗，如仍有不適，請聽取醫生意見。

6、為了您的自身安全，使用試劑前，請做好防護，如穿實驗服，帶手套等。

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第二關：逆轉錄合成cDNA——搭建RNA到qPCR的“橋梁"

RNA無法直接用于PCR擴增，逆轉錄過程就是將RNA模板合成為穩定的cDNA，這一步的效率直接決定了后續定量結果的準確性。選擇合適的逆轉錄試劑盒，并嚴格控制反應條件，是成功的關鍵。

逆轉錄一管化三代預混液(abs60246)標準操作PROTOCOL

1． 冰上配制如下反應體系： 

a. 推薦使用已去除基因組DNA污染的高質量RNA作為模板。

2.輕柔吸打混勻，瞬離；

3.55℃溫育 15 min；注：若目標 RNA 不含 Poly(A) 結構，可預先 25℃溫育 10 min。

4. 反應結束后，85℃溫育 5 min 以終止反應；

5. 將獲得的 cDNA 溶液置于冰上，用于后續實驗；或立即保存于-20℃。

注意事項：

預混液中已經包含 Oligo(dT)20VN 和隨機引物，不僅適用于包含Poly(A) 結構的真核生物mRNA，也適用于不含Poly(A) 結構的原核生物 RNA、真核生物rRNA 和 tRNA等模板，但不適用于miRNA 等小RNA模板。

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同時也推薦使用First-strand cDNA Synthesis Mix With gDNA Remover(abs601510), cDNAdi一鏈合成預混試劑（含去基因組），

第三關：熒光定量PCR——精準量化的“終jiwu器"

熒光定量PCR通過實時檢測擴增過程中的熒光信號，實現對cDNA的定量分析，是評估基因表達水平的金標準。要獲得可靠結果，需兼顧體系配制、程序設置和結果分析三大要點。

SYBR Advanced qPCR SuperMix Kit(abs60087)標準操作PROTOCOL

一、實驗須知：

1. SYBR Advanced qPCR SuperMix Kit是針對兩步法反應開發，變性步驟在95℃下進行，退火/延伸綜合步驟在60℃下進行，同樣適用于Tm低于60℃的引物；

2. 為確保采用SYBR Green進行Real-Time PCR時具有最gao效率，產物長度建議為60-200bp；

3. PCR反應時必須xian進行熱啟動步驟，即在95℃下孵育2min，激活熱啟動DNA Polymerase；

4. 對于96孔模塊PCR儀，建議的反應物終體積為20µL。對384孔模塊PCR儀，建議的反應物終體積為10µL。

二、操作步驟：

1. 將2×SYBR Advanced qPCR SuperMix、模板gDNA或cDNA、引物、ROX Reference Dye（根據需要）以及RNase-Free Water解凍并混勻，根據下表制備反應混合液。由于存在熱啟動機制，構建反應或設置實時定量PCR儀時，無需將樣品一直放置在冰上。

2. 充分混勻反應混合物，并取適當體積加入PCR管或反應板中。

3. 將模板gDNA或cDNA（≤100ng/次）加入含有反應混合液的各個PCR管或孔中。對于兩步法RT-PCR，加入的cDNA（未稀釋的反轉錄反應物）體積不能超過PCR終體積的10%。

4. 根據下表中列出的程序設置實時定量PCR儀。應在進行退火 / 延伸步驟時收集數據。

*注意：

1、熔解曲線分析是實時定量 PCR 儀軟件內置的一項分析步驟。進行此分析時，須遵守儀器提供的說明。

2、如果 PCR 儀無法在這么短的時間內完成數據采集，則以儀器采集數據所需的最短時為準。

3、該溫度也同樣適用于所有Tm低于60℃的引物。

4、循環數取決于模板DNA的量。

5、將 PCR 管或反應板放置在實時定量PCR儀上并啟動PCR程序。

6、對 PCR 產物進行熔解曲線分析。

此項分析功能已內置于實時定量 PCR 儀的軟件中，我們強烈建議您定期進行此項分析以驗證 PCR 產物的特異性。

技術指標：

ROX Reference Dye可加入到2×SYBR Advanced qPCR SuperMix中以便長期儲存。

高ROX Reference Dye機型：ABI Prism7000/7300/7700/7900HT/ 7900HT Fast和ABI Step One /ABI StepOne Plus等；

低ROX Reference Dye機型：ABI Prism7500/7500 Fast/ViiA7/ QuantStudio 3/5/6 /7, Stratagene MX4000/MX3005P/MX3000P系列，MJ Research Chromo4，Opticon (II) ，Corbett Rotor Gene 3000等；

無需加ROX Reference Dye機型：Thermal Cycler Dice Real Time System，Corbett Rotor-gene6000，Bio-Rad CFX系列，Roche LightCycler® 480，Qiagen Rotor-Gene Q，Analytik Jena qTOWER系列等。

產品信息

RNA表達研究的成功，離不開三件套的環環相扣：TriiZol提取的高質量RNA是基礎，逆轉錄的高效轉化是橋梁，熒光定量的精準擴增是核心。掌握了這套TriiZol +逆轉錄+熒光定量的操作指南和注意事項，你就能輕松應對RNA表達分析中的各種難題。一套靠譜的試劑組合+規范的操作流程，就是你科研路上的“神隊友"，幫你高效獲得可靠數據，加速科研成果落地！

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