H9C2 為大鼠心肌細胞，是心肌損傷、氧化應激、心血管相關模型研究常用貼壁細胞。細胞呈長梭形 / 紡錘形，嚴格貼壁、間隙極小、局部會輕微層疊扎堆，該細胞對血清、培養基糖濃度敏感，傳代密度把控不當易出現堆疊老化，分化失控，狀態極易受環境、操作、血清質量影響，本文將針對H9C2的細胞培養流程進行梳理和指導。

一、細胞復蘇

1.【準備工作】水浴鍋提前預熱至 37℃；準備 9ml 培養基在37℃條件下預熱；生物安全柜提前使用紫外照射 30min；

2.【融化】從液氮取出凍存管，37℃水浴快速搖晃融化，約 1-2min；

3. 【重懸】使用75% 酒精擦拭凍存管外壁，生物安全柜內開蓋，將細胞懸液緩慢滴入裝有 9ml 預熱wan全培養基的 15mL 離心管中；

4.【離心】600rpm 離心 5min，棄上清；

5.【重懸】加入1mlwan全培養基輕輕吹打10次細胞懸液。準備一個新的10cm培養皿，在皿蓋上標注細胞名稱、傳代人、代數、日期。加入9mlwan全培養基，再加入1ml細胞懸液。畫十字混勻，使細胞在皿中均勻分布；

6.【培養】放入培養箱中培養。

二、細胞傳代

1.【實驗準備】配制wan全培養基：DMEM（abs9483-500mL）+10%FBS（abs972-500ml）+1%P/S（abs9244-100ml）。提前取出 PBS（abs962-500ml）、wan全培養基、0.25% EDTA - 胰酶（abs47047375-100mL），恢復至室溫；生物安全柜提前使用紫外照射 30min。

2.【鏡檢】在顯微鏡下觀察細胞，細胞密度約 80%，且細胞形態規整即可進行傳代；

3.【細胞清洗】吸棄舊培養基，沿著培養皿壁緩慢加入 2ml PBS，輕輕搖晃培養皿讓 PBS 均勻覆蓋，吸棄 PBS；
注意：如果鏡檢下漂浮死細胞較多，可以再用 PBS 清洗一遍。

4.【細胞消化】加入 1ml 胰酶，輕輕晃動培養皿使得胰酶均勻分布，放至 37℃培養箱中進行消化 1-2min；

5.【細胞收集】顯微鏡下觀察到細胞變圓、回縮、間隙變大，立即加入 2ml 含血清的wan全培養基終止消化。輕輕吹打皿底的細胞，使細胞脫落，并收集細胞至 15ml 離心管中；

6.【離心】1000rpm 離心 5min 后，用槍頭吸棄上清；加入 2ml wan全培養基，輕輕吹打 10-15 次重懸細胞；
注意：該細胞傳代比例 1:3-1:4，可根據傳代比例加入適量wan全培養基。

7.【傳代】準備一個新的10cm培養皿，在皿蓋上標注細胞名稱、傳代人、代數、日期。加入9mlwan全培養基，再加入1ml細胞懸液。畫十字混勻，使細胞在皿中均勻分布；

8.【鏡檢】在顯微鏡下觀察細胞狀態及細胞是否均勻分布，放入37℃，5%CO2培養箱中培養，每隔24H觀察細胞狀態；
注意：不可使H9C2細胞生長過密至匯合、滿層易堆疊老化、分化失控（接觸抑制弱，切勿長時間高密度靜置培養）。細胞密度達到80%即可傳代，每周至少傳代2~3次。該細胞對胎牛血清比較敏感，建議使用愛必信優級血清，用高糖 DMEM，低糖會抑制增殖。

三、細胞凍存

1.【準備工作】細胞凍存液可使用無血清細胞凍存液（abs9417-100mL），也可以自行配制：90%FBS（abs972-500mL）+10%DMSO（abs9187-100mL）。存管提前標注：細胞名稱、代數、凍存人、凍存日期。生物安全柜提前使用紫外照射30min；
注意：該細胞對凍存密度敏感，建議單個皿凍存2-3只。

2.【細胞收集】細胞密度長到80%左右，按照傳代步驟進行細胞收集，600rpm離心之后棄上清；

3.【細胞重懸】加入3ml細胞凍存液，輕輕吹打重懸細胞；

4.【凍存】每管加入1ml混合液至凍存管中，將凍存管放入凍存盒中，放入-80℃冰箱，過夜后轉移至液氮罐中。

四、關鍵注意事項

1、嚴格控制傳代密度
不可使H9C2細胞生長過密至匯合、滿層易堆疊老化、分化失控（接觸抑制弱，切勿長時間高密度靜置培養）。細胞密度達到80%即可傳代，每周至少傳代2~3次。

2、血清及培養基選擇
（1）該細胞對胎牛血清比較敏感、建議使用優級血清培養；
（2）用高糖 DMEM，低糖會抑制增殖；
（3）該細胞更換血清時，建議使用梯度更換的方式。

3、污染控制
易支原體感染，表現為長勢慢、形態變差、莫名漂浮；定期支原體檢測，操作全程無菌。

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