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生物傳感器“探路”，大腸桿菌 L-蘇氨酸產量提升
L-蘇氨酸作為必需氨基酸，在飼料、食品和醫藥領域需求旺盛。系統代謝工程雖已使大腸桿菌生產 L-蘇氨酸效價突破 120 g/L，卻因代謝網絡復雜、靶點難尋而難以兼顧效價與產率。因此，需要創新及高效的方法來加速菌株進化。
“Combining biosensor and metabolic network optimization strategies for enhanced l?threonine production in Escherichia coli”是 2025 年 3 月江南大學饒志明團隊發表在 Biotechnology for Biofuels and Bioproducts 上的一篇文章。該研究提出了一系列工程策略，以進一步提高 L-蘇氨酸生產菌的產能。
首先，利用轉錄組分析篩選在大腸桿菌中能夠感應外源 L-蘇氨酸的啟動子。
隨后，通過將 CysB 突變體與 eGFP 相結合，構建了能夠靈敏響應 L-蘇氨酸濃度變化的熒光報告系統。
接著，利用該生物傳感器輔助 FACS 和 QPix 兩步高通量篩選技術，實現菌株的迭代進化，以捕獲優良突變體。
進一步地，通過多組學分析鑒定有益靶點，并借助 GSMN 優化胞內碳通量分配，以最大化 L-蘇氨酸產量。
本研究不僅開發出一株具有工業應用潛力的 L-蘇氨酸高產菌株，還展示了構建高靈敏度 L-蘇氨酸生物傳感器的新方法，為開發針對其他化學品的生物傳感器提供了新的思路。
圖 1：流程概覽
Results and Discussion
結果與討論
篩選響應 L-蘇氨酸濃度變化的內源遺傳元件
為開發高靈敏 L-蘇氨酸生物傳感器，研究者先對 MG1655 施加 0–60 g/L 外源蘇氨酸并進行轉錄組學分析，篩得 32 個表達量與蘇氨酸正相關的基因；進一步聚焦 21 個啟動子構建 eGFP 報告文庫后，確認 PcysK 響應最佳并呈線性，但天然元件閾值窄、假陽性高，需后續優化。
圖 2：L-蘇氨酸生物傳感器的挖掘、設計與表征
改造傳感器以提高對 L-蘇氨酸的響應
為克服天然傳感器靈敏度低、閾值窄的缺陷，研究對“cys”系列啟動子進行人工改造：
刪除 CysB 結合位點后，L-蘇氨酸響應完全消失，證實 CysB 是必需調控因子。
隨后，在靈敏度更高的 pTrc99A-PcysK-egfp 質粒中過表達 CysB，構建“pSensor，其線性區間被壓縮至 0–4 g/L，靈敏度提高 2.1 倍。
分子對接和定點突變鎖定 CysB-T102 為關鍵位點，T102A 突變體“pSensorThr”響應閾值再升 2.4 倍，且能可靠區分高產（THR36-L19）與無產（THR01）菌株。
與現有系統相比，pSensorThr 誤篩風險低但響應范圍仍窄，需進一步優化響應范圍以擴大適用性。
圖 3：L-蘇氨酸生物傳感器的開發、測試與優化
圖 4：pSensorThr 生物傳感器的開發
高通量篩選輔助鑒定 L-蘇氨酸高產菌株
將溫度敏感突變質粒 MP6ts 導入 THR36-L19，在 30 °C 誘變、42 °C 去質粒，快速構建大規模突變文庫；隨后引入 pSensorThr 并用 FACS、QPix 高通量篩選設備進行 5 輪“突變-篩選”循環，共挑出 50 株高產熒光突變株。搖瓶驗證顯示多數菌株產量優于出發菌，其中 THRM1 產量最高，達 38.97 g/L。
圖 5：pSensorThr 生物傳感器的應用
QPix 在菌株篩選中起到了挑菌標準化/解放手工/高效挑菌的作用。
多組學指導的逆向代謝工程進一步提升 L-蘇氨酸產量
THRM1 高產源于“Tpx C61G”與“SpoT R290H→H290R 回復”兩突變：產率提升≈3%。此外，敲除 tpx 或 spoT 分別微增或嚴重降產，證實二者作用。其余 4 個突變無顯著貢獻。轉錄組顯示 THRM1 重調碳流：EMP 與乙醛酸途徑上調、TCA 下調，pps 高表達補充 PEP；但 pykF、poxB、pflB 過表達造成碳流失。依次敲除這三基因，THRM6 產量升至 41.36 g/L。這些發現明確了關鍵遺傳靶點，也為后續進一步提升產量提供了方向。
圖 6：基于多組學分析的逆向代謝工程解析 L-蘇氨酸高產機制
圖 7：計算機模擬預測新的代謝工程靶點
Summary
總結
本研究開發了一種高靈敏度、高熒光閾值的生物傳感器，并用于高通量平臺篩選優異突變株。通過多組學分析指導的逆向代謝工程和計算機模擬，使工程菌株 THRM13 在 5 L 發酵罐中達到 163.2 g/L 的 L-蘇氨酸產量，糖酸轉化率為 60.3%，為迄今在不使用外源誘導劑和抗生素條件下報道的最高水平。此外，該高通量篩選策略仍可繼續用于菌株的后續迭代進化。
QPix FLEX 微生物克隆篩選系統
參考文獻
Zhenqiang Zhao1,2?, Rongshuai Zhu1,2?, Xuanping Shi1,2, Fengyu Yang1,2, Meijuan Xu1,2, Minglong Shao1,2,Rongzhen Zhang1, Youxi Zhao3, Jiajia You1,2* and Zhiming Rao1,2*.Combining biosensor and metabolic network optimization strategies for enhanced l?threonine production in Escherichia coli. Biotechnology for Biofuels and Bioproducts.2025; 18:37.
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