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天然更安心！QPix 助力微藻代謝生產食用級天然染料
微藻滿足飲食需求的潛力引起了食品行業的關注。根據歐洲食品安全局（EFSA）的數據，消費者對天然食用色素的需求正在增加，他們更喜歡天然產品，而不是可能有潛在毒性的合成食品添加劑1。然而，天然色素可能對光照敏感，當暴露在不同的環境條件（pH 和溫度）下時會變色；此外，它們的顏色范圍通常有限。所有這些因素都促使人們圍繞用作食品染料的新型天然色素進行研發。
食品工業中具有獨特特性的微藻色素的發現，需要高通量自動化的方式，以在更短的時間內篩選大量微藻藻株。利用這項技術，Fermentalg? 實驗室利用 Galdieria sulphuraria 的代謝產生了一種富含 C - 藻藍蛋白的天然藍色色素，被提取并商業化為 BLUE ORIGINS?2。
（BLUE ORIGINS? 與其他微藻衍生染料相比，BLUE ORIGINS? 是一種天然色素，具有在低 pH 和高溫下的穩定性等特性，在食品和飲料行業有廣泛應用，如糖果、飲料和即食谷物等。迄今為止，C - 藻藍蛋白是 FDA 的食品著色劑豁免產品清單中唯一的藍色顏料，適用于生產天然產品3。）
Fermentalg? 科學家開發了一種創新的方法，使用 QPix 420 微生物克隆篩選系統（Molecular Devices?）篩選和挑取微藻藻株。傳統上，克隆挑選是使用無菌移液管尖端或接種環手動進行的，這通常是緩慢、勞動密集和耗時的。QPix 420 系統允許高通量克隆挑取，可達 3000 克隆 / h，挑取效率 >98%。多種熒光通道增加了系統靈活性，能夠根據熒光蛋白表達或熒光色素的形態特征和水平對獨特克隆進行表型篩選。
實驗方法
在尋找一種高產 C - 藻藍蛋白的 Galdieria sulphuraria 藻株過程中，Fermentalg? 獲得并保存了一組具有不同 C - 藻藍素含量的變體。首先將藻株接種在 Gross-agar 培養基4（pH 3）上，并在 37°C、60% 濕度環境中避光培養兩周。然后使用 QPix 420 系統對所有培養板進行成像和分析，通過使用圣誕樹形狀的倒鉤型挑針成功地挑取并進行接種。通過使用內部清洗模塊對針進行在線消毒來保持無菌（圖 1）。
（QPix 提供多種形狀和直徑的挑針來確保與不同微生物的兼容性，提高挑取效率。）
圖 1：使用 QPix 的克隆篩選流程
用熒光法篩選 G.sulphuraria 藻株
G.sulphuraria 富含 C - 藻藍蛋白，一種在藍綠藻中發現的水溶性蛋白，呈現特有的亮藍色。當用紅光激發時，C - 藻藍蛋白發射熒光，峰值在 642 nm5。
在透射光和熒光下，QPix 對兩周大的 G.sulphuraria 克隆進行成像和篩選，這使得能夠客觀地鑒定和選擇產生 C - 藻藍蛋白的克隆。首先，通過 QPix Fusion 軟件獲取透射光和所選熒光下的板的測試圖像（圖 2A & B）。
圖 2：A) 微藻 G.sulphuraria 在透射光下的測試圖像。B) 在熒光通道 (Ex/Em濾光片：628/692 nm) 中獲得相同樣品的測試圖像，以檢測表達 C - 藻藍蛋白的克隆
一旦捕捉到圖像，QPix Fusion 軟件就會根據特征特性對其進行分析，并確定培養板（培養皿、Omnitray 或 QTray）上單個克隆的位置。Fusion 軟件的靈活性允許用戶根據菌落大小、緊湊度、軸比、直徑和最小臨近度等篩選所需的克隆。因此，基于設置的參數，符合的 G.sulphuraria 克隆被包括在內（圖 3，黃色），不符合的被排除在外（圖 3、紅色）。
圖 3：符合設置參數的被選中，顯示為黃色。不符合設置參數的被排除，顯示為紅色。右上角面板：為準確篩選克隆而設置的篩選標準。
定量的熒光強度閾值指定了所需的蛋白質表達水平。為了選擇含有最高濃度 C - 藻藍蛋白的克隆，需要調整熒光強度范圍。對于該實驗，選擇產生平均熒光強度（MFI）值在 36000 和 43000 之間的 C - 藻藍蛋白的克隆（圖 4A & B）。一旦根據用戶定義的標準進行選擇，就可以使用 QPix 420 系統準確地挑取克隆。
圖 4：產生 C - 藻藍蛋白的 G.sulphuraria 克隆的熒光篩選。A) 表達不同水平的 C - 藻藍蛋白的 G.sulphuraria 克隆的代表性熒光圖像，使用紅色熒光通道 (Ex/Em:628/692)。B) 熒光直方圖顯示為選擇的平均強度
高表達 C - 藻藍蛋白克隆的篩選與檢測
最后，使用 QPix 420 系統分析了產生不同含量 C - 藻藍蛋白的不同 G.sulphuraria 藻株，以測試 QPix 區分和選擇高表達 C - 藻藍素克隆的能力，這些克隆在視覺上看起來是深綠色的（圖 5A）。正如預期的那樣，具有低濃度的 C - 藻藍蛋白的克隆在瓊脂平板上呈現白色，而表達平均水平的克隆呈現淺綠色。因此，用 QPix 420 在透射光中對不同克隆進行成像，然后基于 C - 藻藍蛋白熒光強度進行篩選（圖 5B & C）。檢測到深綠色和淺綠色菌落的熒光信號。特別地，基于先前設置的 36000 至 43000 的平均熒光強度值，成功地選擇和挑選了深綠色克隆。最后，熒光成像中白色克隆的消失證實了這些克隆中不存在 C - 藻藍蛋白。
圖 5：高表達 C - 藻藍蛋白克隆的篩選。A) 對具有不同色素沉著的 G.sulphuraria 克隆進行了分析。B) 用 QPix 420 相機檢測到的同一克隆板的透射光 (TL) 圖像。C) G.sulphuraria 克隆的熒光圖像（紅色熒光通道，Ex/Em:628/692nm），被選擇的克隆顯示為黃色，被排除的克隆顯示紅色
總結
由于對天然和可持續食品成分的需求增加，食品行業對微藻的興趣正在上升。Fermentalg? 正在利用微藻代謝來開發和篩選多種能產生低 pH 值和高溫穩定的天然藍色色素作為食品成分的 G.sulphuraria 藻株（BLUE ORIGINS?）。為了加速該產品的工業應用，進行了 G.sulphuraria 藻株克隆的自動化篩選。與傳統篩選方法相比，高通量克隆篩選具有顯著優勢，包括更快地鑒定所需克隆，從而簡化后續的下游分析。
QPix 熒光能力用于選擇產生更高濃度 C - 藻藍蛋白的克隆，從而加快了基于微藻的天然色素生產的規模?？傊咄孔詣踊瘜ξ⒃瀹a品的未來發展前景廣闊。
QPix 420 微生物克隆篩選系統
參考文獻
1. Carocho M, et al. Adding Molecules to Food, Pros and Cons: A Review on Synthetic and Natural Food Additives. Compr Rev Food Sci Food Saf. 2014 Jul;13(4):377-399. doi: 10.1111/1541-4337.12065. PMID:
2. Athane et al., The safety evaluation of phycocyanin-enriched Galdieria sulphuraria extract using 90-day toxicity study in rats and in vitro genotoxicity studies. Toxicology Research and Application 2020.
3. Minxi Wan et al., Comparison of C-phycocyanin from extremophilic Galdieria sulphuraria and Spirulina platensis on stability and antioxidant capacity, Algal Research 2021, Volume 58.
4. Gross, W. & Schnarrenberger, C. (1995): Heterotrophic growth of two strains of the acido-thermophilic red alga Galdieria sulphuraria. Plant Cell Physiol. 36(4): 633-638.
5. Niels T. Eriksen, Production of phycocyanin—a pigment with applications in biology, biotechnology, foods and medicine. Applied Microbiology and Biotechnology, 2008.
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