在生物體內(nèi)，氧化應激是指機體在遭受各種有害刺激時，體內(nèi)活性氧（ROS）產(chǎn)生過多或抗氧化防御系統(tǒng)功能減弱，導致氧化與抗氧化失衡的一種狀態(tài)。抗氧化活性物質能夠清除 ROS，減輕氧化應激對細胞和組織的損傷。非酶法抗氧化活性檢測是評估生物樣本（如植物提取物、食品、血液等）中非酶類抗氧化物質總活性或特定成分抗氧化能力的重要手段，在食品科學、醫(yī)藥研發(fā)、生物化學等領域應用廣泛。

一、非酶法抗氧化活性檢測的重要性

非酶類抗氧化物質是機體抗氧化防御系統(tǒng)的重要組成部分，包括維生素（如維生素 C、維生素 E）、多酚類化合物（如黃酮類、酚酸類）、類胡蘿卜素、谷胱甘肽（非酶促狀態(tài)下）等。這些物質通過直接清除自由基、螯合金屬離子、抑制氧化酶活性等方式發(fā)揮抗氧化作用。與酶法抗氧化系統(tǒng)（如超氧化物歧化酶、*酶等）相比，非酶類抗氧化物質的來源更廣泛，不僅存在于生物體內(nèi)，還大量存在于植物、食品等天然產(chǎn)物中。

非酶法抗氧化活性檢測能夠綜合評估樣本中所有非酶抗氧化物質的總抗氧化能力，或針對特定類型的抗氧化物質進行活性測定，為篩選天然抗氧化劑、研究抗氧化機制、評估食品營養(yǎng)價值、開發(fā)抗氧化藥物等提供重要依據(jù)。

二、常見非酶法抗氧化活性檢測方法

總抗氧化能力（TAC）檢測法

總抗氧化能力檢測法是評估樣本中所有抗氧化物質協(xié)同作用的綜合指標，常用的方法包括：

• 鐵離子還原抗氧化能力法（FRAP 法）

原理：在酸性條件下，樣本中的抗氧化物質能將三價鐵離子（Fe3?）還原為二價鐵離子（Fe2?），F(xiàn)e2?與三吡啶三吖嗪（TPTZ）結合形成藍紫色復合物，在 593nm 處有最大吸收峰。通過測定吸光度的變化，可計算樣本的抗氧化活性，吸光度越大，抗氧化能力越強。

操作要點：反應體系通常為 pH3.6 的醋酸緩沖液、10mmol/L TPTZ 溶液和 20mmol/L FeCl?溶液按 10:1:1 混合，加入樣本后 37℃孵育一定時間，測定吸光度。該方法操作簡便、快速，適用于大量樣本的篩查，但受反應時間和溫度影響較大。

適用范圍：適用于植物提取物、食品、血清等樣本的總抗氧化能力測定。

• 2,2'- 聯(lián)氮 - 雙 - 3 - 乙基苯并噻唑啉 - 6 - 磺酸（ABTS）法

原理：ABTS 在過氧化物和金屬離子作用下生成穩(wěn)定的藍綠色陽離子自由基（ABTS??），樣本中的抗氧化物質可清除 ABTS??，使溶液顏色變淺，在 734nm 處的吸光度降低。通過吸光度的變化計算抗氧化活性，吸光度降低越多，抗氧化能力越強。

操作要點：先制備 ABTS??工作液，將 ABTS 溶液與過硫酸鉀溶液混合，室溫避光孵育 12-16 小時，使用前用磷酸鹽緩沖液稀釋至吸光度為 0.70±0.02。加入樣本后反應一定時間，測定吸光度。該方法靈敏度高，可在水相和有機相中進行，適用于多種類型的樣本。

適用范圍：廣泛應用于食品、藥物、植物提取物等的總抗氧化能力檢測。

• 1,1 - 二苯基 - 2 - *肼（DPPH）法

原理：DPPH 是一種穩(wěn)定的自由基，在 517nm 處有強吸收，呈紫色。當樣本中存在抗氧化物質時，DPPH 自由基被清除，溶液顏色變淺，吸光度降低。通過吸光度的變化計算自由基清除率，清除率越高，抗氧化活性越強。

操作要點：將 DPPH 乙醇溶液與樣本混合，室溫避光反應 30 分鐘后，測定 517nm 處的吸光度。該方法操作簡單、快速，成本低，但受溶劑極性影響較大，對脂溶性抗氧化物質的檢測效果較好。

適用范圍：常用于植物提取物、食品、化妝品等的抗氧化活性初步篩選。

基于自由基清除的特異性檢測法

除了總抗氧化能力檢測，還有針對特定自由基的清除能力檢測方法，以評估樣本對不同類型 ROS 的清除效果：

• 超氧陰離子自由基（O???）清除法

原理：通過黃嘌呤 - 黃嘌呤氧化酶體系產(chǎn)生 O???，O???可還原氮藍四唑（NBT）生成藍色甲臜，樣本中的抗氧化物質清除 O???后，甲臜生成量減少，在 560nm 處的吸光度降低。

操作要點：反應體系包括黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶、NBT 和樣本，37℃孵育一定時間后測定吸光度。該方法特異性較高，可反映樣本對 O???的清除能力。

適用范圍：適用于研究樣本在生物體內(nèi)的抗氧化機制，尤其是與炎癥、衰老相關的氧化應激過程。

• 羥基自由基（?OH）清除法

原理：通過 Fe2?與 H?O?反應（Fenton 反應）產(chǎn)生?OH，?OH 可氧化脫氧核糖生成丙二醛等產(chǎn)物，TBA反應生成紅色復合物，在 532nm 處有吸收峰。樣本中的抗氧化物質清除?OH 后，紅色復合物生成量減少，吸光度降低。

操作要點：反應體系含 FeSO?、H?O?、脫氧核糖、TBA 和樣本，37℃孵育后沸水浴加熱，冷卻后測定吸光度。該方法可特異性檢測樣本對?OH 的清除能力，?OH 是活性*強的 ROS 之一，對細胞損傷較大，因此該方法具有重要的生物學意義。

金屬離子螯合能力檢測法

許多氧化反應依賴金屬離子（如 Fe2?、Cu2?）的催化，抗氧化物質通過螯合這些金屬離子，可抑制氧化反應的發(fā)生。常用的方法是亞鐵離子螯合能力檢測法：

原理：樣本中的抗氧化物質與 Fe2?結合，形成穩(wěn)定的螯合物，從而抑制 Fe2?與菲啰嗪的反應。菲啰嗪與 Fe2?結合生成紅色復合物，在 562nm 處有吸收峰，螯合能力越強，紅色復合物生成越少，吸光度越低。

操作要點：將樣本與 FeSO?溶液混合，孵育后加入菲啰嗪，測定吸光度。該方法適用于評估樣本中具有金屬螯合能力的抗氧化物質（如多酚類、氨基酸等）的活性。

脂質過氧化抑制法

脂質過氧化是指多不飽和脂肪酸在 ROS 作用下發(fā)生氧化分解的過程，會產(chǎn)生丙二醛等有害物質。通過檢測樣本對脂質過氧化的抑制能力，可評估其抗氧化活性：

原理：以亞油酸或大鼠肝勻漿等為脂質體系，在氧化條件下（如 Fe2?催化）發(fā)生脂質過氧化，產(chǎn)生的丙二醛與 TBA 反應生成紅色復合物，樣本中的抗氧化物質可抑制脂質過氧化，使紅色復合物生成量減少。

操作要點：將樣本與脂質體系、Fe2?溶液混合，孵育一定時間后加入 TBA，沸水浴加熱，測定 532nm 處的吸光度。該方法模擬了生物體內(nèi)脂質的氧化過程，更接近生理條件，適用于研究樣本對生物膜氧化損傷的保護作用。