蛋白質轉印具體步驟

    蛋白質轉印，也就是WesternBlot實驗里的“轉膜"步驟，是把凝膠上已經分離的蛋白質，在電場作用下轉移到固相膜上，以便后續進行抗體孵育和檢測。

    這個過程的標準操作方法主要有三種：濕法轉印、半干法轉印和快速轉印。雖然它們的儀器和耗時不同，但核心步驟都包括制作“三明治"結構（凝膠-膜組合）、施加電場和轉印后的處理。以下是各種方法的具體操作步驟：

一、通用步驟：從電泳到轉印前準備

    無論用哪種轉印方法，開始前的準備工作是共通的。

    凝膠準備：電泳結束后，小心撬開玻璃板，切除濃縮膠和多余的分離膠，在轉膜液中平衡5-10分鐘。

    膜的準備：根據蛋白分子量選擇0.22μm或0.45μm的膜。如果是PVDF膜，需要先在甲醇中浸泡活化，再轉入轉膜液中平衡；如果是NC膜，直接在轉膜液中平衡即可。

二、濕法轉印具體步驟

    這種方法是將整個“三明治"浸沒在轉膜緩沖液中，散熱好，轉膜效果穩定。

    浸泡耗材：將海綿墊和濾紙浸入預冷的轉膜液中，充分潤濕。

    制作“三明治"：打開轉印夾，按順序從負極（黑色）到正極（透明/白色）依次放上海綿、濾紙、凝膠、膜、濾紙、海綿。可以用玻璃棒輕輕滾動趕走各層之間的氣泡。

    放入電轉槽：將夾子正確放入轉移槽，倒入預冷的轉膜液，放入冰盒，蓋上蓋子，再將整個電轉槽放在冰浴里。

    設置電源與轉印：連接電源，通常以100-110V恒壓轉印60-90分鐘，或200mA恒流轉印1-2小時。大分子蛋白（>150kDa）可以適當延長時間。

三、半干法轉印具體步驟（快速省試劑）

    這種方法不需要將“三明治"浸沒，直接用浸滿轉膜液的厚濾紙作為離子源，速度快，試劑用量少。

    平衡凝膠與膜：凝膠在轉膜液中平衡5-10分鐘，膜按上述方法處理。

    制作“三明治"：在水平陽極板上，從下到上依次放上濾紙、膜、凝膠、濾紙，每一層都要趕盡氣泡。

    啟動轉印：蓋上陰極板和安全蓋，連接電源。常用電壓為10-15V，轉印15-45分鐘。

四、快速轉印系統具體步驟（分鐘級轉印）

    這是近年發展的技術，以Bio-Rad的Trans-BlotTurbo為代表，使用專用的預裝耗材和高電流，在3-10分鐘內完成轉印。

    準備轉印包：根據凝膠尺寸選擇一次性或半干轉印包。按說明書指示打開包裝，鋪好含緩沖液的底層。

    制作“三明治"：將平衡后的凝膠放在轉印包底層上，覆蓋膜，再用滾輪趕盡氣泡。蓋上預濕的頂層（含緩沖液的濾紙），形成一個完整的“三明治"結構。

    放入儀器并運行：將“三明治"放入儀器中，根據系統提示選擇預設程序，啟動轉印。系統會自動完成整個過程。

五、轉印完成后的操作

    無論用哪種方法，轉印結束后都需要進行以下幾步：

    檢查轉印效果：取出膜，觀察預染蛋白Marker的條帶是否清晰。如果需要，可以用麗春紅染液對膜染色，觀察全部蛋白條帶。

    封閉：將膜放入5%脫脂牛奶或BSA溶液中，室溫下緩慢搖晃封閉1小時，或在4°C下封閉過夜。

    后續步驟：封閉完成后，就可以進行一抗孵育、二抗孵育和化學發光檢測等后續操作了。

總結

    追求穩定通用，尤其是大分子蛋白：選濕法轉印，時間留足1-2小時。

    中小蛋白，想快速出結果：選半干法，操作快，省試劑。

    追求標準化、高效率：選快速轉印系統，幾分鐘就完成。

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