產品核心特性

由艾美捷Bethyl Laboratories推出的抗HIF2?α抗體（貨號A700-003，克隆號BL-95-1A2）是一款重組兔單克隆抗體，經細胞培養上清純化，以Whole IgG形式提供。該抗體針對人源缺氧誘導因子2α（HIF2?α，又稱EPAS1）設計，在多種應用中表現優異，包括染色質免疫沉淀（ChIP）、免疫細胞化學（ICC）、免疫熒光（ICC-IF）、免疫組化（IHC）、免疫沉淀（IP）及免疫印跡（WB）。關鍵參數如下：

參數 詳細信息

靶點 HIF2?α / EPAS1

反應性 人

宿主 兔

克隆性 重組單克隆（克隆號 BL-95-1A2）

格式 Whole IgG

濃度 400 µg/ml

純化方式 從細胞培養上清純化

同種型 IgG

偶聯物 未偶聯

儲存 2 - 8°C

有效期 1年

緩沖液 PBS，含0.1% BSA及0.09%疊d化鈉

免疫原與表位特異性

該抗體識別表位位于人HIF2?α蛋白第400至450位殘基之間（參考序列NP_001421.2，GeneID 2034）。這一區域位于HIF2?α的C端轉錄激活域（TAD）與ODD域（氧依賴降解域）之間，具有較高的抗原性且與其他bHLH-PAS家族成員（如HIF1?α）的序列差異明顯，因此可實現特異性識別。

生產優勢：作為重組單克隆抗體，A700-003由穩定細胞系表達，避免了傳統多克隆抗體的批次間差異，確保長期供應的一致性和可重復性。抗體經親和純化后濃度高達400 µg/ml，為下游多種高靈敏度應用提供了充足保障。

儲存與穩定性

儲存條件：2 - 8°C，禁止冷凍。

有效期：自收貨之日起1年。

緩沖液組成：磷酸鹽緩沖鹽水（PBS），含0.1% BSA及0.09%疊d化鈉（防腐劑）。

應用方法與推薦參數

以下應用均經過驗證，用戶可依據推薦條件直接使用或進行微調。

通用實驗條件

所有Western Blot實驗均采用5% Milk-TBST作為封閉液和抗體稀釋液，一抗孵育過夜（4°C搖動）。

檢測二抗：

細胞裂解液WB：羊抗兔IgG重鏈+輕鏈抗體（A120-101P）

IP洗脫液WB：抗兔IgG輕鏈HRP偶聯抗體 + 5%正常豬血清（S100-020）封閉

各應用推薦參數

應用 推薦稀釋度/用量 關鍵條件提示

ChIP-Seq 10 - 40 µl / 30 µg 染色質 過往批次已驗證適用于ChIP-Seq

免疫細胞化學（ICC） 1:200 - 1:1000 甲醛固定，Triton X-100通透

免疫熒光（ICC-IF） 1:100 - 1:500 同上

免疫組化（IHC） 1:200 - 1:1000 FFPE切片需用枸櫞酸鹽緩沖液pH 6.0高壓修復20分鐘，建議一抗過夜孵育

免疫沉淀（IP） 20 µl / mg 裂解物 本品為高濃度抗體，按體積而非質量添加

免疫印跡（WB） 1:1000 過夜孵育，建議使用同步化細胞或缺氧處理的陽性對照

詳細操作要點

ChIP-Seq：該抗體過往批次已成功用于ChIP-Seq實驗。推薦投入10-40 µl抗體與30 µg染色質共孵育。用戶在使用新批次時應進行qPCR預驗證（如檢測HIF2?α靶基因VEGF、EPO的啟動子富集）。抗體濃度較高（400 µg/ml），建議進行小規模預實驗確定最佳用量。

ICC / ICC-IF：采用4%甲醛室溫固定細胞10-15分鐘，PBS洗滌后使用0.1-0.5% Triton X-100通透5-10分鐘。一抗稀釋于含1% BSA的PBS中，4°C孵育過夜。推薦使用Alexa Fluor偶聯的羊抗兔二抗進行熒光檢測。陽性對照可使用低氧（1% O?）處理24小時的HeLa或786-O細胞（后者因VHL缺失而組成型表達HIF2?α）。

IHC（石蠟切片）：必須進行熱誘導抗原修復。推薦使用壓力鍋或微波爐加熱枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0）至沸騰后維持20分鐘。自然冷卻至室溫后，進行封閉和一抗孵育（4°C過夜）。使用HRP標記的二抗和DAB顯色。陽性組織推薦人腎透明細胞癌或肝細胞癌切片。

IP：按20 µl抗體/mg總蛋白裂解物的比例加入。由于該抗體濃度高（400 µg/ml），20 µl對應8 µg抗體，與常規IP用量相當。推薦使用非變性裂解液（如1% NP-40，150 mM NaCl，50 mM Tris pH 7.4，蛋白酶抑制劑）。4°C旋轉孵育2-4小時，加入Protein A磁珠繼續孵育1-2小時。洗滌后，用SDS上樣緩沖液洗脫。

WB：推薦起始稀釋比為1:1000。HIF2?α分子量約為100-120 kDa（依賴于磷酸化和氧濃度）。注意：在常氧條件下，HIF2?α被VHL/E3泛素連接酶識別并迅速降解，因此WB檢測需使用低氧處理或脯氨酰羥化酶抑制劑（如DMOG、CoCl?）處理的細胞裂解液。陽性對照：CoCl?（100-200 µM，4-6小時）處理的HeLa細胞，或組成型表達HIF2?α的786-O細胞。

別名

basic-helix-loop-helix-PAS protein MOP2、bHLHe73、class E basic helix-loop-helix protein 73、ECYT4、EPAS-1、HIF-1-alpha-like factor、HIF-1α-like factor、HIF2A、HIF-2-alpha、HIF2-alpha、HLF、hypoxia-inducible factor 2 alpha、Hypoxia-inducible factor 2-alpha、member of PAS protein 2、MOP2、PAS domain-containing protein 2、PASD2

使用注意事項

1.防腐劑：緩沖液含0.09%疊d化鈉，有毒性，操作時需佩戴防護用具。疊d化鈉會抑制HRP活性，若用于HRP檢測體系，需確保在封閉和洗滌步驟中充分去除（增加洗滌次數或使用不含疊d化鈉的緩沖液稀釋抗體）。

2.氧濃度控制：HIF2?α在常氧下極不穩定，處理細胞樣品時需嚴格把控氧濃度。建議在缺氧工作站（1% O?）或使用化學穩定劑（如CoCl?，100 µM處理4-6小時；或DMOG，1 mM處理4小時）收集裂解物。裂解緩沖液中應添加蛋白酶抑制劑和去泛素化酶抑制劑（如N-乙基馬來酰亞胺）。

3.陽性對照推薦：

WB：CoCl?處理的HeLa裂解物，或786-O細胞裂解物（組成型表達）。

IHC：人腎透明細胞癌組織（VHL突變，HIF2?α核陽性）。

ICC-IF：低氧處理的786-O或Hep3B細胞。

4.分子量確認：HIF2?α在SDS-PAGE中遷移位置約為100-120 kDa。由于磷酸化修飾，可能出現雙條帶或彌散。使用未處理與磷酸酶處理樣本對比可輔助條帶鑒定。

5.ChIP實驗優化：初次使用建議設置10 µl、20 µl、40 µl三個抗體用量梯度。同時使用陰性對照（兔IgG）和陽性對照抗體（如抗H3K4me3）。固定時間（甲醛1%室溫10分鐘）和染色質剪切長度（200-700 bp）需預先優化。

6.交叉反應性：已驗證人反應性。經序列比對，小鼠Hif2α（NP_034269.2）在400-450區域同源性約85%，該抗體對小鼠樣本的交叉反應性未經驗證。如需檢測小鼠，建議預先通過WB驗證。