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一.細胞培養的基本原理

細胞培養是用酶消化法將組織碎塊分離成單個細胞，用培養基制成細胞懸液，在體外適宜條件下，使細胞生長繁殖，并保留其一定的結構和功能特性。細胞培養與組織培養、器官培養主要不同點在于原始培養的對象不同。細胞培養使用的是單個細胞懸液，組織培養使用的是組織塊(0．5～1立方毫米)或薄片(厚0．2毫米)，而器官培養使用的是器官原基或器官的一部分或整個器官。在組織培養中，細胞自組織塊周圍移出并生長，細胞在生長過程中總有移動(運動)或其它變動，這樣就使被培養的組織難以長期維持其原有的結構和功能。培養時間越長，發生變化的可能性越大，結果常使單一類型的細胞保存下來，終成了細胞培養。在細胞培養中，細胞生命活動和體內細胞一樣，仍然是相互依存的，呈現一定的組織特異性，所以組織培養和細胞培養實際上無嚴格區別。

細胞培養技術是生命科學中常用的研究手段，該方法能排除神經體液因素的影響及肝、腎解毒功能的干擾，觀察某些因素或藥物對培養細胞的直接作用。通過實驗可獲得某一類型細胞的純培養。如心肌組織中心肌細胞約占50％，非心肌細胞占50％；而經純化分離的心肌細胞懸液中，心肌細胞可達95％以上，這樣，心肌細胞原代培養實驗基本不受其它細胞的干擾。在細胞培養實驗中能直接觀察到培養細胞生命活動的動態過程；用定時顯微攝影記錄可發現一些肉眼觀察不到的生命現象；還可利用電鏡手段、同位素標記、放免法和免疫組化法等來研究細胞形態結構及細胞內化學物質的分布。此外，還能節約研究費用。如在某些研究中，用100只動物做實驗所獲得結論與用100張蓋玻片或幾十個培養瓶而獲得結論具有相同的統計學意義，而細胞培養較之大批量的動物飼養花費要小。

但細胞培養方法也存在不足之處：培養細胞失去體內細胞的制約和整體的調節作用，細胞形態和功能會發生一定程度的改變。培養方法、實驗試劑對細胞形態和功能有一定的影響，如胰蛋白酶可破壞細胞表面受體、酶、抗原等。長期體外培養的細胞，由于反復傳代、凍存和操作等因素的影響，可能發生染色體非整倍體改變，呈永生化或癌變的特征。

二.細胞培養的基本設備與用品

(1)細胞培養的基本設備

細胞培養的基本設備有：CO2培養箱，倒置顯微鏡，凈化臺，壓力蒸汽消毒器，自動雙重純水蒸餾器，液氮罐，冰箱，電熱干燥箱，電熱恒溫培養箱，電動吸引器，抽氣泵等。

(2)常用的實驗用品

1.玻璃器皿

細胞培養所用的玻璃器皿應由透明度好、無毒的中性硬質玻璃制成。常用的有以下幾種：國產螺旋口培養瓶[有12．5毫升，25毫升，100毫升等規格，國外培養瓶常以底面積(平方厘米)表示]；培養皿(直徑有3．5厘米，6厘米，9厘米，10厘米等規格)；離心管(5毫升，10毫升)；注射器(1毫升，5毫升等)；用生理鹽水瓶代替的貯存瓶(100毫升，250毫升，500 毫升)；青霉素瓶(5毫升)；西力辛瓶(10毫升)；其它還有尖吸管和移液管，載玻片(厚度0．8～1．2毫米)，蓋玻片(厚度0．12毫米)，貯存尖吸筒用的玻璃筒或金屬筒，漏斗，燒杯，量筒，貯蒸餾水瓶，冷凍管(1．5毫升，2毫升)等。

2.塑料品

多孔培養板規格有4、6、12、24、96孔等，培養皿直徑有3厘米、6厘米、10厘米等。塑料品經消毒滅菌密封包裝，供一次性使用，重復使用的需經特殊方法清洗消毒。塑料器材厚薄均勻，有的表面經特殊處理，細胞易于生長。

3.器械

解剖刀、眼科剪和鑷(直頭和彎頭)、中號圓頭鑷、止血鉗等。

4.雜用品

金屬飯盒、試管架、各種規格膠塞、記號筆、搪瓷盤、吸頭(吸取液體的膠帽)、酒精燈、酒精、碘酒棉球瓶、火柴等。

組織培養中使用多的是吸管、培養瓶、培養皿及各種瓶塞。實驗者手中應有三套器材，瓶塞數要大于瓶數，才能保證實驗中的循環使用。

三.細胞培養用品的清洗與消毒滅菌

(1)清 洗

1.常用玻璃器皿清洗

◇清洗要領

浸泡

初次使用的玻璃器皿呈堿性，表面常附有灰塵和一些對細胞有毒的物質，如鋁和砷等。空氣濕度高時，玻璃器皿表面又易長霉。使用前，新器皿浸泡在5％稀鹽酸中過夜，以中和玻璃表面的堿性物質并去除霉斑；然后經簡單刷洗，流水沖洗(逐片進行)，蒸餾水浸泡，干燥備用。新玻片處理后，短時間不用時，需將它投入95％的酒精中保存，以防玻片長霉。培養后的玻璃器皿應立即投入清水中浸泡，器皿中殘留的細胞、蛋白質一旦干涸，即固著于玻璃表面，極難脫落。

刷洗

用過的玻璃器材經自來水沖洗后，浸入水中煮沸，然后將適量洗滌劑(洗潔精或洗衣粉)投入沸水中繼續煮沸10分鐘，趁熱刷洗器皿內外，刷洗后浸入清水中進行沖洗。

酸泡

刷洗好的玻璃器材干燥后置清潔液中浸泡24小時，清潔液的強氧化作用可清除刷洗不掉的極微量雜質。

◇清洗步驟

玻璃器材煮沸10分鐘→刷洗→流水振蕩沖洗15-20遍→50℃烤干→清潔液浸泡24小時→流水振蕩后沖洗15-20遍→漓水→蒸餾水浸泡2次(每次24小時)→50℃烤干，待包裝。

◇清洗注意事項和要求

①使用后的實驗器材應立即投入清水中。

②浸泡、煮沸、酸泡的器皿內要充滿液體，不得有氣泡。

③刷洗、酸泡后的器材要用流水振蕩沖洗，不得殘留洗滌劑、清潔液。方法是：每瓶灌2／3容積的自來水，振蕩后倒掉，重復15—20次(尖滴管置量杯中沖洗)。

④煮沸前的水面要高于器材5厘米，水沸后投入洗滌劑(直徑35厘米的鋁鍋，用洗衣粉10克左右)。若洗滌劑和實驗器材同時從冷水煮至沸騰或使用過量洗劑，均易腐蝕玻璃表面，使玻璃堿化，pH值上升。

⑤軟毛刷的刷端已掉毛的應該棄去，否則會損害玻璃。玻璃劃痕處易殘留洗滌劑，會改變培養液pH值和毒害細胞。

⑥清潔物品應及時包裝消毒，應注意妥善保存，防止落入灰塵、蟑螂、螞蟻等引起二次污染。

⑦使用后的膠塞與玻璃器材同時煮洗時，膠塞要放在煮鍋的底部。

⑧浸泡器材的蒸餾水容器要，并做好標記，如“蒸餾水Ⅰ盆”、“蒸餾水Ⅱ盆”。

⑨器材清洗干燥后，在以后各步操作時，手指不可接觸器材的使用端。清洗者可戴一次性薄膜手套進行操作，省時又保證清洗質量。

⑩用超聲波儀清洗器材時，清洗要求同上。

2.橡膠制品的清洗

新購置的橡膠制品(膠塞、膠管、橡皮乳頭)的洗滌方法如下：0．5摩爾/升NaOH煮沸15分鐘→流水沖洗→0．5摩爾/升HCl煮沸15分鐘→流水沖洗→自來水煮沸2次→蒸餾水煮沸20分鐘→50℃烤干備用。這樣處理可*除凈膠塞上的硫磺等有毒物質。用過的膠塞，其清洗方法、要求基本同玻璃器材。因膠塞使用面常沾有洗滌劑，流水沖不凈，故膠塞洗刷的重點部位是膠塞使用面，用刷逐個刷洗。在使用過程中，膠塞不能與培養液接觸，以防未洗凈的膠塞污染培養液和細胞。

3．G6除菌濾器的清洗

新G6除菌濾器置玻璃洗液中浸泡24小時，流水緩慢沖洗，至pH值為5．5左右，然后用4倍的蒸餾水緩慢沖洗，再用重蒸餾水緩慢沖洗，烤干，包裝消毒備用。用過的G6除菌漏斗立即浸泡水中(注意：濾器千萬不能干涸)過夜，流水緩慢沖洗24小時或更長時間，至濾面基本疏通時，50℃烤干，濾器再置清潔液中浸泡24小時，或裝滿清潔液自然過濾。流水沖洗及其后的處理同新G6除菌濾器。

4.正壓除菌濾器的清洗

新的或使用后的正壓濾器經稀洗滌劑刷洗水沖洗15分鐘→漓水→去離子水浸泡24小時→三蒸水浸泡24小時→干燥備

5.塑料制品的清洗

塑料制品質地軟且耐腐蝕能力強，但不耐熱，易出現劃痕。其清洗程序為：器皿用后立即用流水沖洗→浸于自來水中過夜→用紗布、棉簽和50℃稀洗液刷洗→流水沖洗(人工沖洗15—20遍)→晾干→浸于清潔液中15分鐘→流水沖洗→蒸餾水浸泡兩次(每次24小時)→晾干備用。

6.清洗液的配制

清潔液

新配制的清潔液為棕紅色，遇有機溶劑或水分增多時變成綠色，表明失效。

先在搪瓷盆中加入蒸餾水，加熱溶解重鉻酸鉀，再將盆置流 動自來水中，待重鉻酸鉀液冷卻后，緩慢加入濃硫酸，邊加邊用玻棒攪動，以混合液溫度不過快上升和不出現重鉻酸鉀結晶為度。

玻璃濾器洗液

取10克硝酸鈉和28．6毫升濃硫酸，放入盛有470毫升蒸餾水的玻璃缸內混勻備用。

清潔液配方

配方成分
常用方
弱液
次強液
強液
重鉻酸鉀（g）
100
50
100
60
清水（ml）
800
1000
1000
200
濃硫酸（ml）
200
90
160
800
硫酸濃度（v/v）
20%
8%
14%
80%
(2)消毒滅菌

1.濕熱消毒

◇濕熱消毒的要求

使用壓力蒸汽滅菌器進行濕熱消毒。

①消毒物品不能裝得太滿，物品之間應留有空隙，以利于消毒器內蒸汽的流動。

②排氣管要插入消毒器的槽內。若排氣管斷裂，要將排氣管與排氣閥調至同一位置。

③玻璃器材使用端(管口、瓶口)要向下放置。

④液體消毒時，用棉塞或插有針頭的膠塞封瓶口。

⑤加熱前將放氣閥摘子置垂直位(開放)，消毒器內空氣隨溫度升高由此閥孔逸出，容器內冷空氣隨之排出。當水煮沸時，有一股較急的蒸汽沖出時，將放氣閥摘子置水平位(關閉)。排除冷空氣的另一種方法是：放氣閥摘子置水平位(關閉)，加熱，壓力升至5磅時，將摘子置垂直位(開放)，冷、熱空氣先后排出(可用手試)。待壓力指針回歸零位時，放氣閥摘子再置水平位(關閉)。

⑥繼續加熱，當消毒器內升壓至需要壓力時，計時并使壓力恒定。壓力維持方法：用電加熱時，可通過電源和滅菌器間的穩壓器調節；沒有穩壓器時，用放氣閥摘子自動排氣調節；用煤氣加熱時，可調節火力維持壓力。根據消毒物品種類不同所選擇的消毒壓力和時間也不同，一般物品(如布類、金屬器械、玻璃器皿等)消毒的要求是15磅20分鐘；橡膠制品為10磅10分鐘；常規液體消毒15磅15分鐘。一般認為在這種壓力下1分鐘內幾乎可殺死所有微生物，但由于消毒物品的包裝內仍可能留有冷空氣，而使高壓蒸汽不能達到消毒器的各部分，所以要延長消毒時間。

⑦消毒完畢，待壓力指針降至零位，再等數分鐘，待放氣閥摘子放完氣后打開消毒器蓋。液體瓶口棉塞換膠皮塞或拔去膠皮塞針頭換新塞。

◇濕熱消毒的注意事項

①不可用安全閥摘子排氣。

②消毒的過程中若出現漏氣現象，可調節消毒器蓋內的膠墊的位置。

③滅菌完畢，不要急于取出消毒，可利用消毒器的余熱去除物品部分濕氣，待半小時左右再移入干燥箱烘干。

2.干熱消毒

　　這種消毒方法主要用于玻璃器皿消毒，一般溫度在160℃維持90—120分鐘就可以殺死芽胞，達到消滅包括細菌、芽孢在內的一切微生物的目的，還可破壞熱原質。消毒完畢，待烘箱內溫度冷卻后再開門，避免因冷空氣突然進入，烘箱內溫度驟降引起玻璃器皿損壞。

3.紫外線消毒

　　紫外線直接照射消毒是各實驗室常用的方法，主要用于培養室空氣、操作臺、塑料培養皿和培養板等表面消毒。進行室內消毒時，紫外線燈應距地面2．5米，使各處有0．06微瓦能量的照射。當室內有塵土時，殺菌能力減弱，故其消毒環境應清潔無塵，并要求消毒空氣濕度小于50％，才能達到殺菌效果。紫外線消毒時產生臭氧，對身體有害，故紫外線消毒停止后30分鐘才可入室工作。目前有的實驗室采用電子滅菌燈代替紫外燈進行空氣消毒。

4.濾過消毒

　　大多數培養用液，如人工合成培養基、血清、酶液等均采用濾過法除菌。常用的除菌濾器有正壓式和負壓式兩種。

◇正壓式(加壓式)濾過消毒。

　　正壓式除菌濾器為金屬結構，中間墊一種特制的混合纖維素酯微孔濾膜，其過濾速度較快，效果較好，被多數實驗室采用。濾膜孔徑有0．6微米、0．45微米、0．22微米三種規格。濾過除菌時，常使用0．22微米孔徑的濾膜。濾器上下層各有一槽，放置硅膠墊圈，將濾膜壓緊固定。

濾膜使用時應注意：

①濾膜薄且光滑，容易移動，安裝時膜位置一定要放正。過分干燥的濾膜很脆，在高壓或高溫干燥時易破裂，因此安裝前可先用三蒸水潤濕濾膜。

②為保證過濾效果，在使用時，每次墊兩張濾膜，上面一張孔徑為0．45微米，下面一張孔徑為0．22微米，或兩張均為0．22微米。

③使用無齒玻片鑷子夾取濾膜，以防止鑷齒弄破濾膜。

④加大壓力時用力應均勻，用后打開濾器對光檢查濾膜是否移動和有無破裂。

⑤濾器濕熱消毒，37℃干燥。濾膜用后丟棄。若過濾少量液體，可將小型針頭濾器安裝在注射器上使用。目前許多廠家有一次性針頭濾器出售。國產針頭濾器易污染。

⑥不同廠家的濾膜質量有差異。

◇負壓式濾過消毒

　　負壓式濾過消毒常使用玻璃濾器。玻璃濾器以燒結玻璃濾板固定在一玻璃漏斗上做成，適于各種培養液的濾過除菌，但不宜濾過血清等粘稠液體，因為容易堵塞濾板孔。根據濾板孔徑大小分為G0—G6幾種規格，一般使用G6型(孔徑為0．22微米)除菌。玻璃濾器漏斗接抽濾瓶，膠管連接抽濾瓶和抽氣瓶，抽氣瓶再與真空抽氣泵相連，或 抽濾瓶用膠管與玻璃水泵相連。負壓式濾過消毒的缺點是濾速較慢，清洗過程繁瑣。

負壓式除菌濾器安裝使用注意事項：

①漏斗與抽濾瓶連接部位要旋緊，并用消毒布包緊連接部位，以保證瓶口不漏氣。

②當抽濾瓶內有負壓形成時，先夾緊抽濾瓶下口與抽氣瓶連接的膠管，再緩慢停止抽氣，防止有菌空氣倒回，污染濾液。自然濾過一段時間，待流速減慢可再行抽氣。

③當漏斗中剩余液體為50～100毫升時，夾緊下口膠管停止抽氣，空氣隨液體自然濾過消毒進入瓶內，瓶內壓力升高，真空解除。

④拆除真空泵和抽氣瓶連接裝置，拆除漏斗與抽濾瓶連接部包布。

⑤漏斗與抽濾瓶連接部位在火焰前方均勻燒灼后，兩者分開，抽濾瓶斜放在超凈臺上，瓶口順風向。

5.消毒劑

　　75％酒精、新潔爾滅、過氧乙酸、乳酸和洗必泰等都是常用的有效消毒劑。0．5％的過氧乙酸在10分鐘內可將芽孢菌和各種病毒殺死；乳酸蒸汽常用做無菌室內或周圍環境的定期消毒；75％酒精常用于超凈臺的臺面、器械、實驗操作者的皮膚等的消毒，0．1％新潔爾滅用于對桌、椅、地面、皮膚、操作臺面進行擦拭或浸泡消毒；0．1％洗必泰水溶液用于皮膚浸泡消毒。

6.塑料器皿消毒

　　塑料器皿不耐高溫，清洗干凈后用75％酒精(分析純)浸泡過夜，滅菌三蒸水浸泡兩次，每次10分鐘，紫外線照射1小時，再經細胞基礎營養液浸泡過渡后，供短期內使用。

7.電離輻射消毒

　　大包裝塑料器皿或不能用上述方法消毒的試劑，可用電離輻射消毒。電離輻射消毒方式有兩種：一種是用2．5百萬拉德60Co產生的γ射線照射48～72小時；另一種是用大于5百萬電子伏特的高能電子束照射。前者穿透能力強，處理效果可靠，后者適于較小物品的滅菌。消毒時由輻照中心專業人員操作。

四.細胞培養用液的配制與除菌

　　動物細胞培養常用液有平衡鹽溶液、培養基(天然和合成)及消化液等。配制這些常用液有嚴格的要求：

·使用高純化的三蒸水。

·按照用液的配方計算所需各成分的用量，然后準確量取，并按規定順序溶于三蒸水中。

·保證各組分*溶解。

·進行pH值測試和調整。

·消毒分裝小瓶，抽樣做無菌實驗，保證用液無菌。

(1)蒸餾水的制備

　　體外培養的細胞對水的質量十分敏感，普通自來水含有大量離子和雜質，對細胞生長不利，甚至會引起細胞死亡。因此，培養細胞所用的水必須高度純化。目前純化水有離子交換水和蒸餾水，前者由于仍帶有非離子物質和有機物質，不適合組織培養使用。細胞組織培養必須使用三蒸水。經金屬蒸餾器制備的蒸餾水又常混有金屬離子，故還需經雙重純水蒸餾器(玻璃)蒸餾。本實驗室組織培養用水制備過程是：自來水→離子交換水→玻璃雙重純水蒸餾器蒸餾兩次。新鮮三蒸水應貯存于棕色磨口試劑瓶中，避免光對蒸餾水的作用。在使用過程中，應盡量減少瓶口開放次數，減少污染機會。蒸餾水存放時間不要超過兩周，現制現用。

(2)平衡鹽溶液(balanced salt solution，BSS)的配制

　　BSS是在Rringer生理鹽水基礎上發展起來的。它是人工合成培養基的基礎用液，又常用來洗滌組織細胞。其主要成分是無機鹽和葡萄糖。無機離子是細胞的重要成分，維持細胞滲透壓及其生存環境的穩定；葡萄糖供給細胞生存所需的能量。BSS液中少量酚紅是作為溶液酸堿度變化的指示劑，溶液變酸時呈黃色，溶液弱堿性(pH7．2—7．4)時呈深紅色，pH值升高到7．6以上時為紫紅色。在碳酸鹽緩沖系統中，NaHCO3具有調節CO2濃度的作用。

　　Hanks液和Earle液是多數培養基的基礎溶液，兩者的主要區別是緩沖能力不同。Hanks液的NaHCO3含量較低(0．35克/升)，其緩沖能力較弱，一般用空氣平衡，即利用空氣中的CO2使溶液pH值平衡。

　　Earle含有高濃度的NaHCO3(2．2克/升)，其緩沖能力較強，溶液pH值需在5％的CO2培養箱中才能達到平衡。

1.BSS液的配制方法(以Hanks液為例)

甲液：Na2HPO4·2H2O 0．06克
KH2PO4 0．06克
MgSO4·7H2O 0．20克
葡萄糖 1．00克
NaCl 8．00克
三蒸水 750毫升
乙液：CaCl2 0．14克
三蒸水 100毫升

①將乙液徐徐加入甲液中。②將0．35克NaHCO3溶解在37℃ 100毫升三蒸水中。③用數滴NaHCO3液溶解0．02克酚紅。④將②、③液移入①液中。⑤用三蒸水定容至1000毫升，充分混勻，4℃冰箱過夜。⑥濾過消毒，小瓶分裝，冷藏。

注意：酚紅對細胞有一定毒性，目前實驗中的用量除0．02克外，還有0．01克和0．005克，也有BSS液中不加酚紅的。酚紅量不同，BSS顏色也不同。

2.配制BSS液的要求

①BSS液中各試劑規格為一級GR試劑或二級AR試劑。

②配制后液體呈桃紅色，pH 7．4左右，沒有混濁和沉淀。

③含鈣離子、鎂離子的物質要單獨溶解。

④可配制10倍濃度的貯存液，濾過消毒，分裝，每瓶10毫升，冰箱保存。使用時每瓶加三蒸水至100毫升。

⑤鈣離子、鎂離子是細胞膜的重要組分，有使細胞凝聚的作用。因此，用于分離細胞的消化液宜用無鈣離子、鎂離子離子的D－Hanks液或PBS液配制。

(3)天然培養基

　　天然培養基有血清、血漿、水解乳蛋白、膠原和組織提取液。

◇血清

　　血清質量好壞是實驗成敗的關鍵。常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、人AB血清、兔血清等，其中以胎牛血清質量，但來源困難，價格較貴。血清中含有：①多種蛋白質(白蛋白、球蛋白、鐵蛋白、酶等)和核酸；②多種金屬離子(K＋、Na＋、Mg2＋、Cu2＋、Ca2＋等)；③激素；④促貼附物質，如纖粘蛋白(fibronectin，FN)．、冷析球蛋白(cold insoluble globulin，CIG)等。血清為細胞提供激素；生長因子、轉移蛋白、基膜成分等，但血清成分個體差異大，常影響實驗結果，其來源又受限制。此外，血清也是污染細胞的一個途徑，它還是分離細胞代謝產物的一種障礙。

　　血清透明，呈淡黃色，不溶血或少溶血。血清經56℃30分鐘滅活后，顏色較深。血清滅活后可能丟失某些成分，但滅活血清性質相對穩定，便于使用和保存。細胞培養用的血清必須保證無細菌、支原體、病毒污染。血清總蛋白量在35—45克/升，球蛋白量不高于20克/升。球蛋白含量高，示胎牛或孕牛感染，因此，球蛋白含量越低的血清，其質量越好。

血清滅活處理步驟

①選用與血清瓶同規格的對照瓶一個。

②對照瓶內放入與血清等體積的水。

③溫度預試：對照瓶內插入2—3支經挑選的溫度計(保證測試溫度的準確性)，放入水浴箱中，接通電源，調節溫度控制鈕，使溫度計所示溫度保持在56℃。

④血清滅活：血清瓶與帶溫度計的對照瓶一齊放入水浴箱中，待溫度計所示溫度上升至56℃時，定時30分鐘。

⑤大瓶血清滅活后，進行分裝。

⑥分裝后，抽樣做無菌試驗，－20～－70℃保存。

使用血清注意事項

①實驗者買到冰凍血清時，首先要觀察血清融化后的顏色和清亮度，若顏色偏紅，或色淺，或出現沉淀，表示血清質差或變質，應當退貨。

②血清凍融后的上層無色透明，活力差，分裝前應將其搖勻。

③血清反復凍融使用，其效價下降又容易污染。

④長時間凍存的血清，一旦凍融后出現沉淀物(此物抑制細胞生長)，應棄去。

⑤若有條件，先購買少量幾種批號血清，進行細胞生長曲線、細胞克隆率檢查，從而篩選出質量好的血清。

⑥為了使整個試驗結果穩定，以便前后比較，應使用同一批號血清。

◇水解乳蛋白

水解乳蛋白為淡黃色粉末，雖易潮解結塊，但不影響使用。

不同批號和牌號質量有差異。水解乳蛋白是乳白蛋白經蛋白酶和肽酶水解后的產物，含有豐富的氨基酸。開始時它是專為猴腎細胞培養設計的，而實際上它對許多細胞系(株)，如Hela細胞和原代細胞都是一種優良培養基。使用時用Hanks液配制成0．5％溶液(酸性)，一般與合成培養基按1：1比例混合使用。

◇鼠尾膠原

膠原是細胞生長的良好基質，它能促進組織和細胞的附著，改善生長表面特性。膠原來源有大鼠尾腱、豚鼠、牛的和牛眼的水晶體等，實驗室常用大鼠尾制膠原。鼠尾膠原為粘度較大的半透明液體，難以濾過除菌，應無菌操作制備膠原。

鼠尾膠原的制備方法

①0．1％醋酸溶液，10磅10分鐘高壓滅菌備用。

②250克體重大白鼠尾一條，置75％酒精中浸泡1小時。

③鼠尾置平皿中切成1．5厘米左右的小段，剝去毛皮，抽出尾腱。

④剪碎尾腱浸泡在150毫升醋酸液中，置于4℃冰箱內，間斷振搖48小時。

⑤4000轉/分離心30分鐘(在4℃條件)。

⑥上清液分裝小瓶，－20℃保存。

⑦殘渣可再加40毫升醋酸液作用24小時后，離心收集保存。

鼠尾膠原使用方法

①將鼠尾膠原均勻涂于器皿的細胞生長面，膠原量以不留液滴為度。

②培養瓶用沾有氨水的消毒棉球封口后置滅菌飯盒內。

③室溫2小時，氨氣與鼠尾膠原作用，膠原凝固。

④用BSS液或基礎營養液洗滌膠原面后，再經細胞培養液浸泡過夜，37℃干燥備用。

◇胚胎浸液

胚胎浸液能促進細胞生長繁殖。常用雞胚和牛胚浸液。將9—11天胎齡的雞胚磨碎，加等量緩沖液，離心收集上清液，即為雞胚浸液，于－20℃—－70℃保存。

(4)合成培養基

合成培養基是根據細胞生存所需物質的種類和數量，用人工方法模擬合成的。目前已設計出許多種培養基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM、Ham'sF12等。這些培養基設計時各有其特定的目的，但實際上適用于多種細胞的培養。合成培養基主要成分是氨基酸、 維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質。

◇合成培養基的主要成分

氨基酸

氨基酸是組成蛋白質的基本單位。不同種類細胞對氨基酸需求不同，體外培養的細胞必須依賴培養液供給12種必需L型氨基酸(精氨酸、組氨酸、半胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸和賴氨酸)。此外，用于培養上皮細胞、內皮細胞、神經細胞等的培養液中還需補加谷氨酰胺。這是因為谷氨酰胺除了作為氮源、碳源外，還能促進各種氨基酸進入細胞，它所含的氮既是核酸中嘌呤和嘧啶的來源，也是合成三、二和一磷酸腺苷的所需物質。實驗又證實，谷氨酰胺在培養液中不穩定，加有谷氨酰胺的培養液，半衰期在4℃時為3周，在36．5℃時為1周，因此使用兩周以上的培養液還需補加原量的谷氨酰胺。

碳水化合物

碳水化合物既是細胞的能量來源，也是合成某些氨基酸的原料，主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖、丙酮酸鈉和醋酸鈉等。

無機離子

無機離子是細胞的重要成分，它們在調節細胞代謝、促進細胞生長發育和維持細胞生理功能等方面有重要作用。

它們還是某些維生素、激素、酶形成過程中*的原料。培養液中除平衡鹽溶液所含無機離子外，有的還含有如Fe2＋、Ze2＋、Cu2＋等離子。

維生素

維生素是維持細胞生長的一種有機化合物，它分為脂溶性維生素和水溶性維生素兩大類。脂溶性維生素有維生素A、D、E、K等；水溶性維生素有維生素C和維生素B1、B2、B6、B12等。

其它成分

較為復雜的培養液中還包括核酸降解物如嘌呤、嘧啶、輔酶A以及氧化還原劑如抗壞血酸、谷胱甘肽等等。

◇合成培養基(液)的配制方法

人工合成培養基是細胞培養基的基礎培養液，稱為基礎培養基，因它提供細胞生存所需的營養成分，還稱為細胞營養液。人工合成培養基有干粉型、1倍工作液型和10倍濃縮型。常用的干粉型培養基性質穩定，便于儲存和運輸，使用方便。使用時按照說明書要求配制，要確保營養液所有組分*溶解，并在消毒和保存過程中不產生沉淀。

RPMI-1640基礎培養液

甲液：RPMI-1640 10．4克
Hepes 2．7～5．4克
三蒸水 700毫升
磁力攪拌至顆粒*溶解(3～4小時，橙黃色)

乙液：NaHCO3 2．0—2．2克
三蒸水 30毫升
37℃，30分鐘顆粒溶解

將甲、乙兩液混合，加水至終體積1000毫升，在4℃靜止2～3小時。濾過除菌，分裝，抽樣做無菌試驗，－20℃凍存。

RPMI—1640血清細胞培養液

RPMI-1640基礎營養液 80毫升
滅活小牛血清 20毫升
青霉素、鏈霉素 各100單位/毫升
pH 7．1—7．2

◇配制合成培養基(液)注意事項

①用三天內制備的玻璃三蒸水配制培養液。

②按二周用量配制為宜，配量過多，存放時間過長會造成培養基老化、變質、產生沉淀。

③培養液中各成分是否*溶解的判斷方法：將培養液置室溫或4℃冰箱30分鐘后，觀察瓶底有無顆粒產生。

④根據實驗需要，在培養液中加入適量37℃單獨溶解的NaHCO3溶液。正常體細胞培養液中NaCO3量為2．0—2．2克/升，腫瘤細胞為1．5—1．7克/升。

⑤干粉培養基不易溶于水，若用CO2加壓濾過或CO2沖擊助溶方法，因CO2用量不易掌握，常出現CO2用量過多使營養液pH值明顯降低的情況，若再用NaHCO3調節pH值時，因NaHCO3的用量也難以掌握，常造成Na＋濃度過高，從而影響細胞的生長繁殖。本實驗室采用空氣CO2助溶法，即將甲液在磁場上攪拌3—4小時，當甲液pH值下降到5．8左右時(橙黃色)，氨基酸和維生素基本溶解。在甲液內再加入溶解有NaHCO3的乙液，兩液混和后，營養液pH值為7．0—7．1。抽濾后pH值上升0．1。此法操作簡便，營養液pH值穩定。

(5)血清細胞培養基

人工合成培養基只能維持細胞生存，要想使細胞生長和繁殖，還需補充一定量的天然培養基，常用的是血清、谷氨酰胺等。另外，為防止污染，培養液中還要添加一定量的抗菌素。基礎培養基加血清、谷氨酰胺、抗菌素等物質后，叫細胞培養基，也叫*培養基。細胞培養基按血清含量多少又分為兩種，即細胞生長培養基和細胞維持培養基。

(6)無血清細胞培養基

血清中究竟哪些成分是細胞生長所必需的呢?幾十年來沒有明確答案。還有一些細胞在血清培養基中不能生長。另外，由于血清成分復雜，常常給細胞培養后的研究工作，如細胞產物的提取、激素和藥物作用機理的研究帶來困難。1975年，Sato成功地用無血清培養基培養了垂體細胞株CH4，還有人用HamF12無血清細胞培養基成功地克隆了CHO細胞。近20多年來已報道了幾十種細胞系(株)在無血清細胞培養基中成功地生長和增殖，這些細胞有內分泌細胞、表皮細胞、神經細胞、淋巴細胞、成纖維細胞和腎細胞等。無血清細胞培養基的使用保證了實驗結果的準確性、可重復性和穩定性，減少細胞污染，簡化了提純和鑒定 McAb、淋巴因子、干擾素等細胞產物的程序，降低疫苗反應。

無血清培養基一般由基礎培養基和替代血清的補充成分組成。

◇基礎培養基

必須根據不同的培養細胞選用合適的基礎培養基。常用的基礎培養基有MEM、NT、M199、F12、DMEM、RPMI—1640、IMDM、DMEM：F12＝1：1、RPMI—1640：DMEM：F12=2：1：1等，其中DMEM和F12混合培養液為多種細胞使用，根據不同細胞的要求，每升中補加Hepes 15毫摩爾，NaHCO31．2—2．4克。

◇無血清培養基的補充成分

補充成分即代替血清的各種因子的總稱。多數無血清培養液必須補加3～8種因子，任何單一因子不能取代血清，至少需兩種。已知有100多種此類因子，其中有些是必需補充因子，如胰島素、(Na2SeO3)和轉鐵蛋白，其它多數為輔助作用因子。補充成分按功能將其分成四類。

激素和生長因子

很多細胞用無血清培養時需加入激素，如胰島素(Ins)、生長激素、胰高血糖素等。此外，甾體激素如孕酮、、雌二醇等也是無血清細胞培養時常用的補充因子。幾乎所有的細胞系都需要Ins，它是一種多肽，能與細胞亡的Ins受體結合形成復合物，調節和控制細胞內多種代謝途徑，加強糖原、蛋白質、甘油三酯和DNA的合成。其原因可能是Ins中混雜某些刺激細胞生長的物質和重要的微量元素，但也有細胞不加胰島素也能生長。前列腺素E1和E2能刺激細胞生長，增加細胞環磷腺苷的水平。有些激素能調節細胞內某種生化反應，如腐胺能促進細胞(B104)快速分裂，是因為激素能增加細胞內腐胺的合成或促進腐胺轉入細胞內。生長因子是維持細胞生存和增殖所必需的物質，依照化學性質可分為多肽生長因子和甾體生長因子。多肽生長因子相對分子質量在10000左右，目前已鑒定的有數十種，其中半數以上是近幾年發現和鑒定的。脊椎動物至少有30種細胞類型(神經、肝、腎、支氣管等)，每種細胞至少有2—3種生長因子對其正常生存和增殖起著調節作用，因此估計機體中約有100多種生長因子。按結構和功能可分為表皮生長因子(EGF)、神經生長因子(NGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)等。生長因子是有效的促有絲分裂原，能縮短細胞倍增時間。

結合蛋白

結合蛋白有兩種，一種是轉鐵蛋白(TF)，它能增強細胞攝取和利用培養液中鐵的能力，還可結合毒性金屬離子，不同細胞需要量不同。有人認為TF中混雜有激素，也足以刺激細胞生長。白蛋白是另一種結合蛋白，它與脂類、金屬離子、激素等結合后，具有刺激細胞增殖作用。

貼壁因子

絕大多數真核細胞在體外生長時需要固著于適當的基底，幫助細胞固著貼附的物質叫貼壁因子或胞外基質。體外培養細胞常于粘著斑(adhension plaque)或其近旁發現纖維粘連蛋白(fibronectin，FN)，此處質膜下正是紐帶蛋白(vinculin)及α－輔助肌動蛋白(α-actin)存在部位。肌動蛋白絲借助這兩種蛋白質附著于質膜的內表面。FN又與非膠原糖蛋白相連。膜上FN受體將細胞外基質FN與細胞內肌動蛋白絲相連。這樣，胞外基質、細胞膜受體及細胞內某些分子直接或間接作用，共同形成細胞結構和功能的統一體，成為控制細胞形態、功能、生長、分化以及某些其它性質(如影響質膜中蛋白質的組織等)的重要因素之一。如體外培養的神經元存活及分化主要決定于所提供的細胞外基質；肌細胞分化，肝細胞和乳腺細胞的形態、代謝，腫瘤細胞的轉移過程，都與細胞外基質有關。

常用貼壁因子儲存液的配制方法：

纖維連結素 以1摩爾/升的尿素PBS液配制成1毫克/毫升的母液，－20℃保存。

多聚賴氨酸(poly-D-lysine)相對分子質量300000，貯存濃度為1毫克/毫升(用D-Hanks液或PBS液配制)。4℃冰箱保存，不能凍存。

膠原(collagens) 貯存濃度為1—3毫克/毫升，溶解在PBS液或0．1摩爾/升的鹽酸或0．1摩爾/升的醋酸液中。

貼壁因子使用方法：

①選擇適宜的貼壁因子。

②將貼壁因子貯存液用三蒸水或PBS液或D-Hanks液稀釋成0．1毫克/毫升的工作液。

③濾過除菌的工作液按50微升/平方厘米涂布培養器皿的細胞生長面。

④室溫靜置5分鐘(膠原基質延長24小時)。

⑤除去多余溶液。

⑥涂布面用滅菌三蒸水洗滌后，再經細胞培養基浸泡過渡，備用。

微量元素

　　微量元素對細胞長期傳代的作用于1981年由Murakam首先報道。硒元素不僅具有抗過氧化物酶對細胞的毒副作用，還可增強其它因子的作用，促進細胞生長。1983年，Clereand用一組復雜的微量元素，使8株雜交瘤細胞生長繁殖。這表明無血清培養液中補加的激素和生長因子的作用，可能是由于混雜一些重要的微量元素所致。

　　此外，實驗證實長期使用無血清細胞培養基培養細胞，會改變細胞的某些特性。是因為在細胞傳代時，常需借助酶的作用，無血清培養基缺乏對細胞保護的成分，殘余的酶會對細胞造成損傷，因此無血清培養基內必須添加酶抑制劑以中止殘余酶的作用。目前常用的是大豆胰酶抑制劑(soybean trypsin inhibitor)，使用濃度為0．1％－0．5％，濾過除菌后，將其加在DMEM／F12基礎培養液內。

　　目前無血清細胞培養基的應用仍處在探索階段，尚無固定配方。應根據不同的細胞和不同的培養要求選擇合適的補充因子。

◇無血清培養液培養哺乳動物細胞系(株)的特點

①無血清培養液中能促進細胞系生長的補加物都是*的。適用于某種細胞株的培養液，可能不適合另一種細胞株的生長。

②同源組織的不同細胞株，所需激素也不同。如人乳腺癌MCF-7和ZR-75-1兩株細胞所需的轉鐵蛋白(TF)量前者大25倍，Ins的量后者大30倍。

③同一種細胞用的基礎營養液不同，所需激素也不同。如HeLa在F12液需加Ins、TF、EGF、FGF和氫化考的松，而在HMCDB105液中只需加TF和EGF兩種成分就能生長。

④不同來源的細胞株需要不同的激素和生長因子。如MCF－7細胞需要EGF，HeLa細胞需要氫化考的松和FGF。

(7)消化液

◇胰蛋白酶液

　　胰蛋白酶(trypsin)是一種黃白色粉末，來自牛或豬的胰臟。當其水解蛋白質時，作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽腱，除去細胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細胞骨架，從而使細胞分離。胰 蛋白酶的活力是用解離酪蛋白的能力表示的，常用的有1：125和1：250兩種，即1份胰蛋白酶能解離125份或250份酪蛋白。胰蛋白酶適用于消化細胞間質較少的軟組織。胰蛋白酶對細胞的分離作用與細胞的類型和細胞的性質有密切關系。不同的細胞對胰蛋白酶液的濃度、作用溫度和作用時間等要求也不一樣。一般來說，濃度越大、溫度越高、作用時間越長，對細胞的分離能力也越大，但超過一定限度就會損傷細胞。常用的胰蛋白酶液的濃度是0．25％和0．125％，作用溫度是37℃或室溫，pH7．4左右。許多學者認為Ca2＋、Mg2＋和血清的存在，都會降低其活力，所以要用無Ca2＋、Mg2＋的D-Hanks液配制酶液。細胞一旦分散后，可用血清培養液終止其對細胞的消化作用。0．25％胰蛋白酶液的配制方法如下。

過濾消毒法

①按實驗需要稱取酶粉，用少量D-Hanks液將胰蛋白酶粉調成糊狀。

②加適量D-Hanks液(橙紅色)，磁力攪拌3～5天即可溶解(室溫和4℃間斷進行，室溫高于30℃要減少酶液在室溫中的攪拌時間)。

③溶解后的酶液(深紅色)濾過除菌，分裝，－20℃凍存。

高熱消毒法

利用胰蛋白酶在酸性條件下有較好的熱穩定性，對其進行高熱消毒。

①按實驗需要稱取酶粉溶于1毫摩爾/升pH3．0的HCl中。

②酶液和2倍D-Hanks液同時在0．1兆帕，120℃條件下滅菌20分鐘。

③兩液冷卻至室溫時，等量混勻。酶液濃度高時，消毒后有少量的沉淀，去除沉淀后，兩液等體積混勻。然后用10摩爾/升的NaOH調消化液pH值至7．2(橙紅色或深紅色)。

④經計算，消毒后酶濃度下降50％。如消毒前酶濃度為0．1％－0．5％，消毒后為0．05％～0．25％。高熱消毒法比過濾消毒法更加簡便、安全、可靠。

◇EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)溶液

　　EDTA·2Na是一種化學螯合劑(商品名為Vorson)，它對細胞有一定的解離作用，并且毒性小，使用方便。常用D-Hanks液配—成0．02％EDTA工作液，高壓滅菌后使用。EDTA的作用原理是：一些組織，尤其是上皮組織，在生長過程中需Ca2＋和Mg2＋維持組織的完整性，EDTA從細胞生存環境中奪取這些離子，形成螯合物，從而使細胞分離，因此，胰蛋白酶和EDTA混合使用可提高消化效率。EDTA只用于消化傳代細胞。EDTA作用不受血清抑制，故消化后需*去除，否則會影響細胞生長。

◇膠原蛋白酶液

　　膠原酶(collagenase)的主要作用是使細胞間質的脯氨酸多肽水解，從而使細胞離散。膠原酶消化的不是細胞表面，而是細胞間質。該酶不同批號或同一批號不同生產日期都有質量差異。目前國內多數實驗室使用的膠原酶大多是從芽孢桿菌中提取出來的。溶組織梭狀芽孢桿菌膠原酶中含羧菌肽酶(0．57—0．59單位/毫克)具有較強的細胞毒性，能破壞細胞膜上的蛋白質和多肽，從而導致細胞膜通透性改變。因此，用它消化組織時，應采取多步收集法(20～30分鐘/次)，這樣才可獲得完整細胞膜和大活細胞收率。膠原酶在Ca2＋和Mg2＋存在下仍有活性，血清亦不能抑制其活性，故消化后應充分漂洗。不同來源的膠原酶對于不同類型膠原纖維的水解作用強弱不等。

　　膠原酶液配制方法：用基礎營養液或Hanks液配制，常用劑量分別為200單位/毫升或0．1—0．3毫克/毫升。膠原酶粉用Hanks或基礎營養液調成糊狀，液體加至定量后，置磁場攪拌至基本溶解，濾過除菌分裝，－20℃凍存。

　　此外，鏈霉蛋白酶、胃膠原酶、透明質酸酶、粘蛋白酶、蝸牛酶和分散酶(dispase)都可作為消化液，但價格昂貴，保存困難，故較少使用，只在獲取某類特殊細胞情況下使用。也有實驗室將膠原酶和胰蛋白酶混合使用分離細胞，效果也不錯。其原因是細胞間質的膠原結構對一般的蛋白水解酶有抗性，聯用時，膠原酶首先水解膠原，繼而胰蛋白酶協同解離細胞。

(8)pH調整液

◇NaHCO3溶液

　　常用的濃度有7．4％、5．6％、3．7％三種，配制時用37℃三蒸水溶解后通過濾膜過濾除菌，分裝于安瓿中，4℃冰箱保存，每支一次用完。使用時，NaHCO3液要逐滴加入，并不時攪動培養液，以防pH值過高。

◇10％醋酸液

高壓滅菌，分裝，4℃冰箱保存。使用方法和要求同NaHCO3液。

◇Hepes液

　　Hepes[4－(2－hydroxyethyl)，－1－peperazineethane sul－phonic acid]是一種氫離子緩沖劑，它可以長時間保持較強的緩沖作用，維持恒定的pH值。20毫摩爾/升的濃度對細胞無毒性，多數細胞都能適用。

(9)200毫摩爾/升L－谷氨酰胺

　　L-谷氨酰胺2．9222克(M＝146．15)，加適量50℃三蒸水溶解，定容至100毫升，濾過除菌，1毫升/安瓿，－20℃保存。使用時每100毫升培養基中加1毫升谷氨酰胺。

(10)抗菌素液

　　在組織培養工作中，培養液內需加適量抗菌素，以抑制可能存在的細菌和霉菌的生長，而不影響細胞的生長。通常是青霉素和鏈霉素聯合使用。在特殊情況下，選擇哪一種抗菌素、劑量多少、何時加入等等，與污染源、抗菌素的抗菌范圍、抗菌素的穩定性等有密切關系。

◇青霉素、鏈霉素(雙抗)液

　　用10毫升Hanks液或三蒸水溶解100萬微克的硫酸鏈霉素，用8毫升硫酸鏈霉素液溶解80萬單位青霉素粉，即成每毫升青霉素、鏈霉素各10萬單位的母液。使用時，在100毫升培養基內加母液0．1毫升，則培養基內青霉素、鏈霉素終使用濃度為每毫升100單位。

◇卡那霉素液

　　將1瓶卡那霉素(50000微克/瓶)溶于5毫升Hanks液中，即成10000微克/毫升的母液。使用時每100毫升培養基內加0．5毫升母液，即每毫升培養液內終使用濃度為50微克/毫升。

◇制霉菌素液

　　因其不能溶于水，故只能制成5000單位/毫升的懸液，使用時每100毫升培養基內加0．5毫升懸液，即每毫升營養液內含25單位的制霉菌素。

(11)細胞用液的分裝方法和要求

◇細胞用液的分裝方法

①使用正壓濾器時，采用邊過濾邊分裝的方法。瓶口的液體用于酒精棉球擦去，火焰消毒，加塞包裝。

②使用負壓濾器時，借助消毒吸管將液體移入分裝瓶內，其它操作同上。

◇細胞用液的分裝要求

①行嚴格無菌操作。盡量減少試劑在空氣中的暴露時間。

②根據配量準備分裝瓶和瓶塞，分裝瓶規格、數量應根據實驗需要準備。避免因包裝瓶過大、貯液時間過長或反復凍融使用造成營養成分丟失和微生物污染。按一次用量或一周內用量挑選小包裝瓶。融化后的液體置4℃保存。

③分裝前做好分裝量標記，分裝瓶內液體量要小于瓶容積的2/3。

④做好分裝瓶標記，包括試劑名稱、濃度、配制日期、組號。