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TUNEL 與 ELISA檢測(cè)凋亡的方法比較
TUNEL法 
細(xì)胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3'-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒(méi)有DNA的斷裂，因而沒(méi)有3'-OH形成，很少能夠被染色。TUNEL實(shí)際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)測(cè)定，并可檢測(cè)出極少量的凋亡細(xì)胞，因而在細(xì)胞凋亡的研究中被廣泛采用.

ELISA法測(cè)細(xì)胞凋亡
細(xì)胞凋亡時(shí)，Ca2+,Mg2+離子依賴的內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶將雙鏈DNA從各核小體間連接區(qū)裂斷，產(chǎn)生單或寡合苷酸小體，各核小體的DNA與核組蛋白H2A,H2B,H3,H4形成緊密的復(fù)合物而對(duì)內(nèi)源性核酸酶有抵抗使之不被內(nèi)源性核酸酶裂解。主要使用單克隆抗DNA抗體和抗組蛋白抗體直接檢測(cè)DNA和組蛋白。

◆ 幾種檢測(cè)凋亡的方法
一、形態(tài)學(xué)觀察方法
1、HE染色、光鏡觀察：凋亡細(xì)胞呈圓形，胞核深染，胞質(zhì)濃縮，染色質(zhì)成團(tuán)塊狀，細(xì)胞表面有“出芽”現(xiàn)象。
2、丫啶橙（AO)染色，熒光顯微鏡觀察：活細(xì)胞核呈黃綠色熒光，胞質(zhì)呈紅色熒光。凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)呈黃綠色濃聚在核膜內(nèi)側(cè)，可見細(xì)胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。
3、臺(tái)盼藍(lán)染色：如果細(xì)胞膜不完整、破裂，臺(tái)盼藍(lán)染料進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞變藍(lán)，即為壞死。如果細(xì)胞膜完整，細(xì)胞不為臺(tái)盼藍(lán)染色，則為正常細(xì)胞或凋亡細(xì)胞。此方法對(duì)反映細(xì)胞膜的完整性，區(qū)別壞死細(xì)胞有一定的幫助。
4、透射電鏡觀察：可見凋亡細(xì)胞表面微絨毛消失，核染色質(zhì)固縮、邊集，常呈新月形，核膜皺褶，胞質(zhì)緊實(shí)，細(xì)胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細(xì)胞吞噬現(xiàn)象。
二、DNA凝膠電泳
（一）、檢測(cè)原理
細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死，其細(xì)胞DNA均發(fā)生斷裂，細(xì)胞內(nèi)小分子量DNA斷增加，高分子DNA減少，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)DNA斷。但凋亡細(xì)胞DNA斷裂點(diǎn)均有規(guī)律的發(fā)生在核小體之間，出現(xiàn)180－200bpDNA斷，而壞死細(xì)胞的DNA斷裂點(diǎn)為無(wú)特征的雜亂片斷，利用此特征可以確定群體細(xì)胞的死亡，并可與壞死細(xì)胞區(qū)別。
（二）結(jié)果判斷
正常活細(xì)胞DNA 電泳出現(xiàn)階梯狀（LADDER)條帶；壞死細(xì)胞DNA電泳類似血抹片時(shí)的連續(xù)性條帶。
三、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)核小體測(cè)定
凋亡細(xì)胞的DNA斷裂使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)核小體。核小體由組蛋白及其伴隨的DNA斷組成，可由ELISA法檢測(cè)。
（一）檢測(cè)步驟
1、將凋亡細(xì)胞裂解后高速離心，其上清液中含有核小體；
2、在微定量板上吸附組蛋白體’
3、加上清夜使抗組蛋白抗體與核小體上的組蛋白結(jié)合‘
4、加辣過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗DNA抗體使之與核小體上的DNA結(jié)合’
4、加酶的底物，測(cè)光吸收制。
（二）用途
該法敏感性高，可檢測(cè)5*100/ml個(gè)凋亡細(xì)胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡檢測(cè)。該法不需要特殊儀器，適合基層工作，但是不能測(cè)定凋亡細(xì)胞發(fā)生的絕多對(duì)量。
四、流式細(xì)胞儀定量分析
（一）檢測(cè)原理
細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，其細(xì)胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常細(xì)胞與壞死細(xì)胞之間。利用這一特點(diǎn)，被檢測(cè)細(xì)胞懸液用熒光素染色，利用流式細(xì)胞儀測(cè)量細(xì)胞懸液中細(xì)胞熒光強(qiáng)度來(lái)區(qū)分正常細(xì)胞、壞死細(xì)胞核凋亡細(xì)胞。
（二）應(yīng)用價(jià)值
流式細(xì)胞儀檢測(cè)具有以下特點(diǎn)：
1)、檢測(cè)的細(xì)胞數(shù)量螅虼似浞從橙禾逑赴牡蟯鱟刺冉獻(xiàn)既?BR>2)、可以做許多相關(guān)性分析
3)、結(jié)合被檢測(cè)細(xì)胞的DNA含量的分析，可確定凋亡的細(xì)胞所處的細(xì)胞周期
■檢測(cè)形態(tài)學(xué)及細(xì)胞膜完整性的Hoechs-PI雙染色法
細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，其細(xì)胞膜的通透性液增加，但其程度介于正常細(xì)胞和壞死細(xì)胞之間，利用這一特點(diǎn)，被檢測(cè)細(xì)胞懸液用熒光素染色，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞懸液中細(xì)胞熒光強(qiáng)度來(lái)區(qū)分正常細(xì)胞、壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。
利用Hoechs-PI染色法，正常細(xì)胞對(duì)染料有抗拒性，熒光染色很淺，凋亡細(xì)胞主要攝取Hoecha染料，呈現(xiàn)強(qiáng)藍(lán)色熒光，而壞死細(xì)胞主要攝取碘化丙啶（PI)而呈強(qiáng)的紅色熒光。
■DNA斷原位標(biāo)記法
凋亡細(xì)胞DNA斷原位末端檢測(cè)技術(shù)是指在細(xì)胞（或組織）結(jié)構(gòu)保持不變的情況下，用熒光素、或生物素標(biāo)記的脫氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate，DUTP)和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT)相反應(yīng)與凋亡細(xì)胞裂解后3·的羥基（－OH）端結(jié)合，經(jīng)顯色反應(yīng)后檢測(cè)DNA裂解點(diǎn)的技術(shù)。
DNA段原位標(biāo)記法有二種：
1、原位缺口轉(zhuǎn)移（in situ nick-translation,ISNT)技術(shù)，它是利用DNA多聚酶I將標(biāo)記的核苷酸連接到斷裂DNA的3·－OH端
2、原位缺口末端標(biāo)記技術(shù)（in situ end labelling technique,ISEL)，即TUNEL法，它是利用TdT將標(biāo)記的DUPT接到3·-OH端。研究證明，TUNEL法的敏感性遠(yuǎn)高于ISNT，尤其對(duì)早期凋亡的檢測(cè)，TUNEL更為合適。
■檢測(cè)細(xì)胞膜成分變化的Annexin V 聯(lián)合PI法
1、原理：在細(xì)胞凋亡早期位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸（PS)遷移至細(xì)胞膜外測(cè)。磷脂結(jié)合蛋白V（Annexin V）是一種鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，它于PS具有高度的結(jié)合力。因此，Annexin V可以作為探針檢測(cè)暴露在細(xì)胞外測(cè)的磷脂酰絲氨酸。故利用對(duì)PS有高度親和力的Annexin V，將Annexin V標(biāo)記上熒光素（如異硫氰酸熒光素FITC），同時(shí)結(jié)合使用PI拒染法（因壞死細(xì)胞PS亦暴露于細(xì)胞膜外測(cè)，且對(duì)PI高染）進(jìn)行凋亡細(xì)胞雙染法后用流式細(xì)胞儀即可檢測(cè)凋亡細(xì)胞。
2、結(jié)果判斷：正常活細(xì)胞Annexin V 、PI均低染；凋亡細(xì)胞Annexin V高染、PI低染；壞死細(xì)胞Annexin V/PI均高染。
3、應(yīng)用價(jià)值：細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，膜上的PS外露早于DNA斷裂發(fā)生，因此Annexin V聯(lián)合PI染色法檢測(cè)早期細(xì)胞凋亡較TUNEL法更為靈敏。又Annexin V聯(lián)合PI染色不需固定細(xì)胞，可避免PI染色因固定造成的細(xì)胞碎片過(guò)多及TUNEL法因固定出現(xiàn)的DNA段丟失。因此，Annexin V聯(lián)合PI法更加省時(shí)，結(jié)果更為可靠，是目前為理想的檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法。 

◆ 幾點(diǎn)參考
1.大部分凋亡細(xì)胞可能并不見得有非常典型的凋亡表型，如電鏡的染色體邊集、凋亡小體等，DNA電泳也不見得都有DNA ladder，但對(duì)某些指標(biāo)來(lái)說(shuō)還算穩(wěn)定，如PI染色及TUNEL法，所以如果某個(gè)方法效果不好，可以換用其他方法檢測(cè)
2.壞死與凋亡的區(qū)分傳統(tǒng)上認(rèn)為是無(wú)序與有序的過(guò)程，樓上所說(shuō)的線粒體腫大也是以前的一個(gè)傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)，但現(xiàn)在有很多人認(rèn)為壞死的發(fā)生也是有序發(fā)生的，因此也有了程序化壞死一說(shuō)，在很大程度上，由于凋亡是時(shí)間依賴性的過(guò)程，細(xì)胞發(fā)生凋亡也并非同步化的，凋亡的晚期與壞死進(jìn)行區(qū)分是困難的，而且我認(rèn)為如果不是對(duì)于凋亡或是壞死本身通路進(jìn)行研究的話，強(qiáng)行區(qū)分是沒(méi)有意義的

◆細(xì)胞凋亡檢測(cè)技術(shù)與方法 
細(xì)胞凋亡（Apoptosis），又稱細(xì)胞程序性死亡(PCD: Programmed Cell Death)，是指細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下，遵循自身的程序，自己結(jié)束其生命的過(guò)程。它是一個(gè)主動(dòng)的，高度有序的，基因控制的，一系列酶參與的過(guò)程。細(xì)胞凋亡概念提出至今還不到30年的時(shí)間，但由于它在保證多細(xì)胞生物的健康生存過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色，對(duì)個(gè)體的正常發(fā)育及細(xì)胞凋亡紊亂在病理學(xué)研究中的重要作用，引起了人們對(duì)其機(jī)制和組分的廣泛而深入地研究，成為目前生命科學(xué)界為熱門話題之一，也是生命科學(xué)界乃至社會(huì)各界爭(zhēng)相投入的研究領(lǐng)域。從近年的SCI排名中我們可以看到，信號(hào)傳導(dǎo)方面的文章遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)位于第二位的人類基因組方面的，而信號(hào)傳導(dǎo)中一個(gè)重要的前沿領(lǐng)域就是細(xì)胞凋亡的研究。隨著這方面研究的持續(xù)升溫，涌現(xiàn)出了大量新的技術(shù)和方法對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè)，其中不少已經(jīng)有商品化的產(chǎn)品出現(xiàn)，大大加速了研究的進(jìn)程。具體來(lái)說(shuō)，針對(duì)凋亡的不同階段有以下一些方法（概括如圖1）： 
1． 早期檢測(cè): 
1) PS(磷脂酰絲氨酸)在細(xì)胞外膜上的檢測(cè): 
PS從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)移到外側(cè)在細(xì)胞受到凋亡誘導(dǎo)后不久發(fā)生, 可能作為免疫系統(tǒng)的識(shí)別標(biāo)志。AnnexinV，一個(gè)鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，能專一性的結(jié)合暴露在膜外側(cè)的PS，再通過(guò)簡(jiǎn)單的顯色或發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。由于這是一種凋亡早期的活細(xì)胞檢測(cè)（懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞都適用），可與DNA染料或別的晚期檢測(cè)方法相結(jié)合來(lái)標(biāo)記凋亡的發(fā)展階段。 
美國(guó)生物試劑公司CLONTECH和INTERGEN公司分別開發(fā)了多種標(biāo)記的Annexin V產(chǎn)品，簡(jiǎn)便快速，10分鐘就可完成檢測(cè)。其中帶熒光標(biāo)記的Annexin V-EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein)及Annexin V-FITC，靈敏度高，可作為FACS（流式細(xì)胞分選）方法篩選凋亡細(xì)胞的基礎(chǔ)。由于融合蛋白Annexin V-EGFP，EGFP與PS 的結(jié)合比例為1：1，還可進(jìn)行定量檢測(cè)。除此之外，還提供生物素偶聯(lián)的Annexin V，可通過(guò)常用的酶聯(lián)顯色反應(yīng)來(lái)檢測(cè)。另外，MACS公司將磁珠包被Annexin V，可采用磁分選方法篩選凋亡細(xì)胞。 

2）細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變的檢測(cè)： 
這反應(yīng)了細(xì)胞凋亡研究中相對(duì)較新的趨勢(shì)，研究什么樣的氧化還原環(huán)境引起下游事件的發(fā)生。CLONTECH公司的ApoAlertTM Glutathione Detection Kit通過(guò)熒光染料monochlorobimane(MC 體外檢測(cè)凋亡細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中谷光苷肽的減少來(lái)檢測(cè)凋亡早期細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的變化。 
正常狀態(tài)下,谷光苷肽(glutathione：GSH)作為細(xì)胞的一種重要的氧化還原緩沖劑。細(xì)胞內(nèi)有毒的氧化物通過(guò)被GSH還原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH還原酶迅速還原。這一反應(yīng)在線粒體中尤為重要，許多呼吸作用中副產(chǎn)物的氧化損傷將由此被去除。在Jurcat和一些其它類型的細(xì)胞中，細(xì)胞膜中有可被凋亡信號(hào)啟動(dòng)的ATP依賴的GSH轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)GSH的排除非常活躍時(shí)，細(xì)胞液就由還原環(huán)境轉(zhuǎn)為氧化環(huán)境，這可能導(dǎo)致了凋亡早期細(xì)胞線粒體膜電位的降低，從而使細(xì)胞色素C（三羧酸循環(huán)中的重要組分）從線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞液中，啟動(dòng)凋亡效應(yīng)器caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。 
由于 GSH與氧化還原作用及線粒體功能密切相關(guān)，此項(xiàng)檢測(cè)除了對(duì)研究細(xì)胞凋亡的起始非常有用外，還可用于心臟病、中風(fēng)等疾病治療的研究。但有些細(xì)胞如：HeLa 和3T3細(xì)胞凋亡時(shí)沒(méi)有明顯的GSH水平的變化，不能用此法檢測(cè)。 

3）細(xì)胞色素C的定位檢測(cè) 
細(xì)胞色素C作為一種信號(hào)物質(zhì)，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用。正常情況下，它存在于線粒體內(nèi)膜和外膜之間的腔中，凋亡信號(hào)刺激使其從線粒體釋放至細(xì)胞液，結(jié)合Apaf-1 （apoptotic protease activating factor-1）后啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)：細(xì)胞色素C/Apaf-1復(fù)合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。 
細(xì)胞色素C氧化酶亞單位Ⅳ（cytochrome c oxidase subunit Ⅳ：COX4）是定位在線粒體內(nèi)膜上的膜蛋白，凋亡發(fā)生時(shí)，它保留在線粒體內(nèi)，因而它是線粒體富集部分的一個(gè)非常有用的標(biāo)志。 
ApoAlertTMCell Fractionation Kit不用超離心，可從凋亡和非凋亡細(xì)胞中快速有效分離出高度富集的線粒體部分，再進(jìn)一步通過(guò)Western雜交用細(xì)胞色素C抗體和COX4抗體標(biāo)示細(xì)胞色素C和COX4的存在位置，從而判斷凋亡的發(fā)生。 

4) 線粒體膜電位變化的檢測(cè)： 
在凋亡研究的早期，從形態(tài)學(xué)觀測(cè)上線粒體沒(méi)有明顯的變化。隨著凋亡機(jī)制研究的深入，發(fā)現(xiàn)線粒體凋亡也是細(xì)胞凋亡的重要組成部分，發(fā)生很多生理生化變化。例如，在受到凋亡誘導(dǎo)后線粒體轉(zhuǎn)膜電位會(huì)發(fā)生變化，導(dǎo)致膜穿透性的改變。MitoSensorTM，一個(gè)陽(yáng)離子性的染色劑，對(duì)此改變非常敏感，呈現(xiàn)出不同的熒光染色。正常細(xì)胞中，它在線粒體中形成聚集體，發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光。凋亡細(xì)胞中，因線粒體穿膜電位的改變，它以單體形式存在于細(xì)胞液中，發(fā)出綠色熒光。用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可清楚地分辨這兩種不同的熒光信號(hào)。CLONTECH公司的ApoAlert Mitochondrial Membrane Sensor Kit就采用這種原理來(lái)檢測(cè)線粒體膜電位的變化。但是，這種方法不能區(qū)分細(xì)胞凋亡或其他原因?qū)е碌木€粒體膜電位的變化。 

2． 晚期檢測(cè)： 
細(xì)胞凋亡晚期中，核酸內(nèi)切酶（某些Caspase的底物）在核小體之間剪切核DNA，產(chǎn)生大量長(zhǎng)度在180-200 bp 的DNA段。對(duì)于這一現(xiàn)象的檢測(cè)通常有以下兩種方法： 
1） TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling） 
通過(guò)DNA末端轉(zhuǎn)移酶將帶標(biāo)記的 dNTP （多為dUTP）間接（通過(guò)）或直接接到DNA段的3’-OH端，再通過(guò)酶聯(lián)顯色或熒光檢測(cè)定量分析結(jié)果。美國(guó)Intergen公司提供多種標(biāo)記方法，直接熒光標(biāo)記，介導(dǎo)熒光標(biāo)記或過(guò)氧化物酶聯(lián)顯色，可做細(xì)胞懸液、福爾馬林固定或石蠟處理的組織、細(xì)胞培養(yǎng)物等多種樣本的檢測(cè)。其中，直接標(biāo)記步驟少，操作簡(jiǎn)便。而間接標(biāo)記有信號(hào)放大的作用，檢測(cè)靈敏度高。 

2) LM-PCR Ladder (連接介導(dǎo)的PCR檢測(cè)) 
當(dāng)?shù)蛲黾?xì)胞比例較小以及檢測(cè)樣品量很少（如活體組織切片）時(shí)，直接瓊脂糖電泳可能觀察不到核DNA的變化。CLONTECH公司的ApoAlert®LM-PCR Ladder Assay Kit通過(guò)LM-PCR（ligation-mediated PCR）,連上特異性接頭，專一性地?cái)U(kuò)增核小體的梯度片段，從而靈敏地檢測(cè)凋亡時(shí)產(chǎn)生的核小體的梯度片段。此外，LM-PCR 檢測(cè)是半定量的，因此相同凋亡程度的不同樣品可進(jìn)行比較。 

上述兩種方法都針對(duì)細(xì)胞凋亡晚期核DNA斷裂這一特征，但細(xì)胞受到其它損傷（如機(jī)械損傷，紫外線等）也會(huì)產(chǎn)生這一現(xiàn)象，因此它對(duì)細(xì)胞凋亡的檢測(cè)會(huì)受到其它原因的干擾。 

3) Telemerase Detection (端粒酶檢測(cè)) 
這是相對(duì)來(lái)說(shuō)推出較早，用得較多的一種方法。端粒酶是由RNA和蛋白組成的核蛋白，它可以自身RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成端粒區(qū)重復(fù)序列，使細(xì)胞獲得“永生化”。正常體細(xì)胞是沒(méi)有端粒酶活性的，每分裂一次，染色體的端粒會(huì)縮短，這可能作為有絲分裂的一種時(shí)鐘，表明細(xì)胞年齡、復(fù)制衰老或細(xì)胞凋亡的信號(hào)。研究發(fā)現(xiàn)，90%以上的癌細(xì)胞或凋亡細(xì)胞都具有端粒酶的活性。Intergen公司的TRAP-eze Telemerase Detection Kit在1996年推出。它提供特定的寡核苷酸底物，分別與底物及端粒重復(fù)序列配對(duì)的引物。如果待測(cè)樣本中含有端粒酶活性，就能在底物上接上不同個(gè)數(shù)的6堿基（GGTTAG）端粒重復(fù)序列，通 
過(guò)PCR反應(yīng)，產(chǎn)物電泳檢測(cè)就可觀察到相差六個(gè)堿基的DNA Ladder現(xiàn)象（參見圖4）。此外，Intergen公司還提供用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測(cè)的試劑盒. 
同樣，這種檢測(cè)方法也不專對(duì)細(xì)胞凋亡，檢測(cè)結(jié)果也不純反應(yīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。 

3．mRNA水平的檢測(cè) 
研究者們發(fā)現(xiàn)了很多在細(xì)胞凋亡時(shí)表達(dá)異常的基因，檢測(cè)這些特異基因的表達(dá)水平也成為檢測(cè)細(xì)胞凋亡的一種常用方法。據(jù)報(bào)道，F(xiàn)as 蛋白結(jié)合受體后能誘導(dǎo)癌細(xì)胞中的細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxic T cells）等靶細(xì)胞。Bcl-2 和bcl-X (長(zhǎng)的) 作為抗凋亡（bcl-2 和bcl-X）的調(diào)節(jié)物，它們的表達(dá)水平比例決定了細(xì)胞是凋亡還是存活。一般多采用Northern雜交和RT-PCR走膠對(duì)它們進(jìn)行檢測(cè)。隨著近年來(lái)熒光定量PCR技術(shù)的發(fā)展，用定量PCR技術(shù)來(lái)檢測(cè)基因表達(dá)水平無(wú)疑比之前者更快更準(zhǔn)確。Intergen公司的Amplifluor™ Apoptosis Gene Systems就根據(jù)這一新技術(shù)原理，通過(guò)檢測(cè)fas, bax-alpha 和 bcl-X (長(zhǎng)的) 基因的 mRNA表達(dá)水平來(lái)進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。 

以上介紹了針對(duì)凋亡不同階段特征的檢測(cè)方法，隨著凋亡機(jī)制研究的深入，近年來(lái)還發(fā)展了許多針對(duì)特定的凋亡途徑的檢測(cè)，如抗體法，酶活性測(cè)定等等，Cell Signeling technology公司，DAKO公司，Santa-Cruz公司，Calbiochem & Oncogene公司都緊跟科研潮流，開發(fā)了大量的抗體及活性測(cè)定產(chǎn)品。

隨著對(duì)細(xì)胞凋亡的研究和認(rèn)識(shí)的不斷深入，對(duì)包括腫瘤細(xì)胞和組織在內(nèi)的不同種類病理標(biāo)本的細(xì)胞凋亡的檢測(cè)已成為一種迫切需要。目前，多種方法已得到較廣泛的應(yīng)用。然而如何選擇適當(dāng)?shù)姆椒ú?duì)檢測(cè)的結(jié)果作出正確的判斷及愉如其分的解釋仍是值得探討的問(wèn)題。本文簡(jiǎn)要評(píng)述幾種常用的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法。

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一、  細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察
細(xì)胞凋亡（apoptosis）的命名主要是根據(jù)某些單個(gè)細(xì)胞死亡時(shí)細(xì)胞碎裂如花瓣或樹葉散落般的形態(tài)學(xué)特征。目前對(duì)細(xì)胞凋亡的認(rèn)識(shí)正不斷得到深化，檢測(cè)凋亡細(xì)胞的方法也逐漸增多，但形態(tài)改變?nèi)允谴_定細(xì)胞凋亡的可靠的方法。
光學(xué)顯微鏡觀察
凋亡細(xì)胞的主要特征為核染色質(zhì)致密深染，形成致密質(zhì)塊，有時(shí)可碎裂。在HE染色的組織切片中細(xì)胞體積縮小，胞質(zhì)致密、嗜酸性染色增強(qiáng)，并可形成凋亡小體。在組織中凋亡細(xì)胞常以分散單個(gè)形式存在，凋亡細(xì)胞與周圍細(xì)胞分離，不引起炎癥反應(yīng)。本方法簡(jiǎn)便易行，但在細(xì)胞密集的組織中對(duì)于改變不典型的細(xì)胞判斷較困難，常缺乏較為特征的指標(biāo)，具有較強(qiáng)的主觀性，重復(fù)性差。本方法可用于調(diào)亡現(xiàn)象的初步觀察，作為分析指標(biāo)之一。

檢測(cè)方法：細(xì)胞涂片或組織石蠟切片作HE染色或Giemsa染色，在高倍物鏡下觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)改變，結(jié)合顯微測(cè)量工具可作凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)。

視頻時(shí)差顯微技術(shù)（video time-lapse microscopy）
本方法用于細(xì)胞培養(yǎng)，通過(guò)相差顯微鏡可動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞凋亡的變化過(guò)程，尤其是觀察細(xì)胞表和外形的變化。凋胞與基質(zhì)分離，胞體變圓、收縮、出泡，有的細(xì)胞拉長(zhǎng)，出現(xiàn)釘狀突起，特續(xù)數(shù)小時(shí)后細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞溶解，通過(guò)連續(xù)觀察，本方法可養(yǎng)壑培養(yǎng)中的凋亡細(xì)胞，但不能用于病理組織。

檢測(cè)方法：收集2×105細(xì)胞/ml培胞，置于多孔培養(yǎng)板，加入凋亡誘導(dǎo)劑，在帶有自動(dòng)攝像裝置的相差顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞的動(dòng)態(tài)改變，每隔分鐘30秒作序列攝影，連續(xù)24小時(shí)。如同進(jìn)進(jìn)行熒光染色，可參熒光晃微鏡下觀察和攝影。

電子顯微鏡觀察
關(guān)于凋亡細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特征，包括透射電鏡和掃描電鏡下的改變，在許我文獻(xiàn)中已有詳盡描述。凋亡細(xì)胞的典型形態(tài)改變?nèi)绨|(zhì)的固縮，染色質(zhì)濃縮成半月形或帽狀附于核膜，核的碎裂和凋亡小體形成等，在透射電鏡下得到好的體現(xiàn)。為凋亡細(xì)胞判定提供了可靠的依據(jù)。本方法的缺點(diǎn)是樣品制作過(guò)程較復(fù)雜，且儀器、設(shè)備的費(fèi)用昂貴，較難廣泛大量開展。由于樣品范圍局限，在凋亡細(xì)胞數(shù)較少時(shí)需進(jìn)行大量的觀察才能觀察到典型的凋亡改變。還應(yīng)指出的是，在觀察體外培養(yǎng)的凋亡細(xì)胞時(shí)，常可見到各階段的改變，并可見到較多典型的凋亡細(xì)胞時(shí)，常可見到各階段的改變，并可見到較多典型的凋亡小體很少見到，出現(xiàn)較多的是凋亡初期胞體收縮、染色質(zhì)邊聚和后期凋亡小體（或整個(gè)凋亡細(xì)胞）被吞噬和降解的現(xiàn)象。一些不典型的改變?nèi)菀妆缓雎裕谟^察時(shí)要特別予以注意。

檢測(cè)方法：透射電鏡標(biāo)本經(jīng)戊二醛和餓酸雙重固定，丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸枸椽酸電子又重染色，透射電鏡觀察。掃描電鏡標(biāo)本經(jīng)戊二醛和餓酸雙重固定，乙醇逐級(jí)脫水，CO2臨界點(diǎn)干燥，真空噴金，掃描電鏡觀察。

流式細(xì)胞技術(shù)
流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞是通過(guò)檢查其光射特征及熒光參數(shù)時(shí)行的。細(xì)胞穿過(guò)流式細(xì)胞儀的激光束集點(diǎn)時(shí)使激光發(fā)生散射，分析散射光可以提供細(xì)胞大小及結(jié)構(gòu)的信息。散射光包括前向散射光和左向角散射光兩種，前向散射光的強(qiáng)度與細(xì)胞大小、體積相產(chǎn)，右向角射光的強(qiáng)度與細(xì)胞結(jié)構(gòu)的析射性、顆粒性（granu-larity）有關(guān)。細(xì)胞凋亡過(guò)程中出現(xiàn)的形態(tài)改變?nèi)缂?xì)胞皺縮、胞膜起泡、核濃縮和碎裂等可以使光散射特性發(fā)生改變。早期凋亡細(xì)胞主要表現(xiàn)為前向散射光減弱而右向角散射光增強(qiáng)或不變，前者反映了細(xì)胞的皺縮，后者反映了細(xì)胞的核逐縮及碎裂。晚期凋亡細(xì)胞的前向散射光和右向角散射光均減弱。由于光散射牧場(chǎng)生并非凋亡細(xì)胞的特異性指標(biāo)，細(xì)胞的機(jī)械性損傷和細(xì)胞壞死也可以使前向散射光減弱。因此，只有將光散射特性的檢測(cè)與熒光參數(shù)的檢測(cè)結(jié)合起來(lái)才能準(zhǔn)確地辨認(rèn)凋亡細(xì)胞。
細(xì)胞凋亡過(guò)程中核酸內(nèi)切酶在DNA分子核小體間的降解，導(dǎo)致小分子DNA漏出，核DNA含量下降，細(xì)胞熒光染色后作流式細(xì)胞儀分析，可以發(fā)現(xiàn)在DNA直方圖上正常二倍體細(xì)胞的Go/G1峰前出現(xiàn)一個(gè)亞二倍體峰（xub-G1峰，即AP峰--apoptotic peak）,代表凋亡細(xì)胞。根據(jù)此亞二倍體峰可以計(jì)算凋亡細(xì)胞的百分率。此外，流式細(xì)胞術(shù)還可以通過(guò)測(cè)定線粒體膜的電位、溶酶體質(zhì)子泵的活性及細(xì)胞DNA/總蛋白質(zhì)比例等方法辨認(rèn)凋亡細(xì)胞。

檢測(cè)方法：獲取密度1×106細(xì)胞/ml左右的細(xì)胞懸液，精洗，固定，熒光染料染色，上流式細(xì)胞儀分析。

二、細(xì)胞凋亡的細(xì)胞化學(xué)測(cè)定

細(xì)胞凋亡的細(xì)胞化學(xué)測(cè)定包括細(xì)胞表面（細(xì)胞膜）的結(jié)構(gòu)和通透性改變的測(cè)定和細(xì)胞核DNA改變的測(cè)定。根據(jù)應(yīng)用的范圍，又可分為細(xì)胞群休和單個(gè)細(xì)胞測(cè)定兩種，以下僅介紹其中幾種較為常用的方法。

碘化丙啶（propidium iodide,PI）檢測(cè)
早期死亡細(xì)胞膜通透性狀態(tài)的不同是區(qū)分細(xì)胞凋亡和壞死的一個(gè)重要指標(biāo)，凋亡細(xì)胞在進(jìn)入終溶解階段前，胞膜通透性無(wú)明顯改變，相對(duì)分子質(zhì)量大的與DNA結(jié)合的熒光染料（如PI)不能時(shí)入凋亡細(xì)胞內(nèi)，而相對(duì)分子質(zhì)量小的熒光染料（如Hoechest 3342或33258等）仍能被細(xì)胞攝取。應(yīng)用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可區(qū)分和壞死細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)DNA出現(xiàn)Hoechest 3342標(biāo)記而不出現(xiàn)PI標(biāo)記的為凋亡細(xì)胞。

檢測(cè)方法：獲取11×106細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，先用PI染色，再行Hoechest3342染色，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析或熒光顯微鏡觀察。PI及Hoechest3342均使用340nm紫外線激發(fā)，前者熒光為紅色（620nm）,后者熒光為藍(lán)色（480nm）。正常細(xì)胞藍(lán)色強(qiáng)。早期凋亡細(xì)胞由于DNA的漏出藍(lán)色稍弱并有少量的紅色熒光，晚期凋亡細(xì)胞紅色熒光加強(qiáng)。壞死細(xì)胞紅色熒光強(qiáng)。

膜聯(lián)蛋白（annexin）V標(biāo)記
正常細(xì)胞的細(xì)胞膜磷脂分布是不對(duì)稱的，磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine,PS）位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，在細(xì)胞凋亡時(shí)轉(zhuǎn)至細(xì)胞膜外表面，這一改變被認(rèn)為是特導(dǎo)性的，并且可作為凋亡細(xì)胞表面改變的標(biāo)記。PS表面化發(fā)生于凋早期，其機(jī)制尚不清，可能是一種導(dǎo)致機(jī)體吞噬凋亡細(xì)胞的信號(hào)。膜聯(lián)蛋白V是Ca2+依賴的磷脂結(jié)合蛋白，對(duì)PS具有高度親和力，熒光標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V與細(xì)胞表現(xiàn)PS結(jié)合，再用顯微鏡或流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，可以觀察凋亡過(guò)程中細(xì)胞膜PS的表面化。結(jié)合PI染色進(jìn)行雙參數(shù)檢測(cè)尚能區(qū)分正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞。正常細(xì)胞膜聯(lián)蛋白V（-）PI（-），早期凋亡細(xì)胞膜聯(lián)蛋白V（+）PI（-），晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞膜聯(lián)蛋白V（+）PI（+）。有研究表明膜聯(lián)蛋白V標(biāo)記僅有不到三分之一的凋亡細(xì)胞出現(xiàn)陽(yáng)性標(biāo)記，其原因尚不明。同時(shí)需注意度的是凋亡后期溶解階段，細(xì)胞碎片也可出現(xiàn)明顯的陽(yáng)性著色。

檢測(cè)方法：1×106細(xì)胞/ml細(xì)胞懸液，先后用膜聯(lián)蛋白V--FITC及PI染色，流式細(xì)胞儀分析，獲得由四個(gè)象限組成的細(xì)胞直方圖（cytogram），每個(gè)象限的細(xì)胞數(shù)目就是在檢測(cè)細(xì)胞總數(shù)在所點(diǎn)的組份。左下象限代表正常細(xì)胞（An-PI-）,右下象限代表早期凋亡細(xì)胞（An+PI-），右上象限代表晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞（An+PI+）,左上象限代表細(xì)胞收集過(guò)程中出現(xiàn)的損傷細(xì)胞（An-PI+）。用生物素標(biāo)記膜聯(lián)蛋白V還可以作體內(nèi)試驗(yàn)。將生物素標(biāo)記膜聯(lián)蛋白V注射小鼠體內(nèi)，30分鐘后處死，迅速取出要研究的組織置于甲醛內(nèi)固定，然后，常規(guī)石蠟切片，脫蠟、水化，用親和素標(biāo)記的過(guò)氧化物酶程程序孵育，DAB顯色，光鏡下觀察凋亡細(xì)胞。

DNA瓊脂凝膠電泳法
細(xì)胞凋亡時(shí)，在內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的作用下，DNA在核小體間被切割成180-200bp整數(shù)倍的單或寡核苷酸片段，在電泳時(shí)表現(xiàn)為特征性的“梯形帶”。自Wyllie把內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶降解產(chǎn)生“梯形帶”與細(xì)胞凋亡相聯(lián)系以來(lái)，“梯形帶”被作為細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要的生化指標(biāo)。盡管有報(bào)道指出，實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)典型的形態(tài)改變時(shí)可不伴有核小體間的DNA降解，對(duì)這一指標(biāo)提出質(zhì)疑，本方法仍被廣泛應(yīng)用。但此方法敏感性不高，大量凋亡細(xì)胞同時(shí)存在時(shí)才出現(xiàn)典型的結(jié)果，且只能被用于細(xì)胞群體，不能用于組織的原位檢測(cè)。

檢測(cè)方法：培養(yǎng)細(xì)胞清洗、離心，加入細(xì)胞裂解液裂解，高速離心，取上清液用酚/抽提二次，RNA酶消化，然后加到含溴已錠的1％-2％的瓊脂糖凝膠的樣品的孔中進(jìn)行電泳，后在紫外線燈下觀察和攝影。
DNA裂解的原位檢測(cè)
在細(xì)胞水平檢測(cè)DNA裂解的原位標(biāo)記技術(shù)已越來(lái)越多地被用于組織切片和培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞凋亡時(shí)，由于DNA的裂解，形成單或寡核小體的雙鏈相對(duì)分子質(zhì)量小的片段及在相對(duì)分子質(zhì)量大的DNA上形成單的繼裂（缺口，nick）。此類斷裂可用生物素、或熒光素標(biāo)記的核苷酸在3`-OH端予以顯示。通常采用的酶是DNA聚合酶I或未端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT），前者使核苷酸結(jié)合于缺口，需要模板存在，標(biāo)記方法通常被稱為“原位缺口平移”(insitu nick translation,ISNT),后者使核苷酸在雙鏈的斷端延伸，不需要模板的存在，其方法被稱為未端記（end labeling）、加尾法（tailing reaction）或TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）。上述方法，尤其是TUNEL的應(yīng)用已很廣泛，其優(yōu)點(diǎn)是可用于原位標(biāo)記，可用于病理組織，并可進(jìn)行定量分析。值得注意的是壞死期由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶和蛋白質(zhì)酶的何等用，DNA被切割成大小不等的片段，也可出現(xiàn) 陽(yáng)性反應(yīng)。組織或細(xì)胞外理不當(dāng)時(shí)可出現(xiàn)假陽(yáng)性。因而，TUNEL等方法對(duì)凋亡細(xì)胞的標(biāo)記是選擇性的。而不是特異性的，TUNEL或其他DNA裂解原位標(biāo)記的分析應(yīng)結(jié)合陽(yáng)性細(xì)胞的形態(tài)，尤其是核的特征，細(xì)胞的分布和有無(wú)炎癥反應(yīng)，除外非凋亡的陽(yáng)性反應(yīng)。

檢測(cè)方法：石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，蛋白質(zhì)酶K消化，TdT酶和核苷酸混合液孵育，顯色（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記可用DAB顯色，堿性磷酸酶標(biāo)可用NBT+BCIP顯色），復(fù)染，脫水，封片。凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色（NBT+BCIP顯色）或者棕黃色（DAB顯色）。

凋亡蛋白質(zhì)酶（Caspase）-3及其底物的檢測(cè)

凋亡蛋白質(zhì)酶是一類半胱氨酸蛋白質(zhì)酶，具有特異性水解底物分子天冬氨酸（Asp）殘七C端肽鍵功能，是近年隨著調(diào)亡研究的深入而發(fā)現(xiàn)的重要凋亡分子。迄今已有13個(gè)分子得到命名，分別為凋亡蛋白質(zhì)酶1-13。基中凋亡蛋白質(zhì)-3是被認(rèn)為在多種組織、細(xì)胞類型中常涉及的凋亡效應(yīng)分子。活化的凋亡蛋白質(zhì)酶-3僅在凋亡細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，因此，檢測(cè)凋亡蛋白質(zhì)酶-3的活性有助于發(fā)現(xiàn)早期的凋亡細(xì)胞。一般采用人工合成四肽熒光底物如DEVD-AMC，凋亡蛋白質(zhì)酶-3在D與AMC之間水解，釋放熒光物質(zhì)、AMC，后者在紫外線激發(fā)下發(fā)出波長(zhǎng)為430-460nm的熒光，通過(guò)流式細(xì)胞儀或分光光度計(jì)對(duì)其強(qiáng)度進(jìn)行定量，從而測(cè)定凋亡蛋白質(zhì)酶-3的活性。由于醛對(duì)凋亡蛋白質(zhì)酶-3的水解活性抑制作用，因此同時(shí)加入含醛四肽如DEVD-CHO可以抑制凋亡蛋白質(zhì)酶-3對(duì)DEVD-AMC的水解，不產(chǎn)生熒光。這樣的抑制試驗(yàn)可作為對(duì)照，使凋亡蛋白質(zhì)酶-3的活性分析更有特異性。但是，上述方法不適用于組只切片，因此有人嘗試采用針對(duì)活化的凋亡蛋白質(zhì)酶-3亞基的抗體，通過(guò)免疫組化顯示凋亡細(xì)胞，然而其敏感性及特異性尚不能令人滿意。

檢測(cè)方法：培養(yǎng)細(xì)胞（也可以預(yù)先作凋亡誘導(dǎo)并在不同時(shí)段收集細(xì)胞）在裂解液內(nèi)裂解、離心、去上清液。加入凋亡蛋白質(zhì)酶-3的底物（如DEVD-AMC）孵育，同時(shí)用不加底物的樣品作對(duì)照，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，加有底物的樣品釋放出的熒光強(qiáng)度樣對(duì)照樣品明顯增強(qiáng)。如加入DEVD-AMC時(shí)再加入DEVD-CHO，樣品釋放的熒光強(qiáng)度與對(duì)照樣品無(wú)差異。

凋亡蛋白質(zhì)酶-3導(dǎo)致細(xì)胞凋亡是通過(guò)水解或滅活一些細(xì)胞關(guān)鍵蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)的，因此檢測(cè)凋亡蛋白質(zhì)酶-3底物的改變也有助于辨認(rèn)細(xì)胞的凋亡。PARP是個(gè)被認(rèn)識(shí)的凋亡蛋白質(zhì)酶-3底物，它的相對(duì)分子質(zhì)量為116000，水解后形成相對(duì)分子質(zhì)量為85000及相對(duì)分子質(zhì)量為25000的兩個(gè)片段，用運(yùn)載相對(duì)分子質(zhì)量為85000片段的抗體可以觀察細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。細(xì)胞骨架蛋白中的CK-18被凋亡蛋白質(zhì)酶-3水解后，在其C端的第387-396位氨基酸殘基形成一個(gè)新的抗原表位，用抗此表位的抗體可以在組織切片上辨認(rèn)凋亡細(xì)胞。另外一種細(xì)胞骨架蛋白質(zhì)肌動(dòng)蛋白（actin）被水解后產(chǎn)生一種稱為“fractin”的片段，在凋亡早期出現(xiàn)，并認(rèn)為與細(xì)胞膜的起泡有關(guān)，可能有助于早期凋亡細(xì)胞的辨認(rèn)。總之，隨著對(duì)凋亡蛋白質(zhì)酶及其底物的進(jìn)一步研究，將會(huì)發(fā)現(xiàn)更有價(jià)值的有助于檢測(cè)凋亡細(xì)胞的方法。

三、展望

除了以上介紹的幾種較常用檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方尖，還有一些尚未被列入的檢測(cè)方法，新的方法正將出現(xiàn)。盡管用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法較多，但形態(tài)學(xué)觀察，尤其是透射電鏡觀察仍具有不可替代的作用，只是其應(yīng)用受到一定限制。在細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)方法中，迄今沒(méi)有任何一種方法具有足夠的敏感性和特異性，尤其在病理組織中要作出準(zhǔn)確定量分析仍較為因難。在目前情況下標(biāo)本和病變的特點(diǎn)，選擇多種適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行綜合檢測(cè)，常可行到較準(zhǔn)確結(jié)果，同樣重要的是，要充分理解各種方法的原理及應(yīng)范圍，并對(duì)結(jié)果作出合理的分析和判斷。隨著對(duì)細(xì)胞凋亡認(rèn)識(shí)的深化和有關(guān)技術(shù)的進(jìn)展，期待更敏感、更特異的方法面世，這對(duì)于病理狀態(tài)（包括腫瘤）中細(xì)胞凋亡的研究將具有重要意義。

◆  有關(guān)細(xì)胞爬片
1. 處理細(xì)胞爬片：用滅菌的去離子水將多聚賴氨酸配成0.1mg/ml,處理載玻片過(guò)夜即可。用前再用去離子水漂洗一次，就可直接接種細(xì)胞！

2. 熱療對(duì)細(xì)胞內(nèi)熱休克蛋白70的誘導(dǎo) 
陳必良1，安曉汾2，辛?xí)匝?，王德堂1，郭慧玲1（1第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科，
陜西西安 710032；2第四軍醫(yī)大學(xué)吉林軍醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，吉林省 吉林市，132011） 
【摘要】目的 探討腫瘤細(xì)胞（以人卵巢癌細(xì)胞為例）在受熱不同時(shí)間、不同間隔后細(xì)胞內(nèi)熱休克蛋白70表達(dá)的異同；明確人卵巢癌細(xì)胞對(duì)熱耐受的敏感程度。方法 體外培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞HO-8910，制成細(xì)胞爬片。加熱溫度設(shè)為42℃，實(shí)驗(yàn)分成兩部分：①加熱時(shí)間分別設(shè)為15、30、60、90、120、150min，加熱后立即固定細(xì)胞；②將細(xì)胞加熱120 min后，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中復(fù)溫不同時(shí)間，收集復(fù)溫后1h、4h、6h、12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h后的細(xì)胞爬片固定。然后將兩組細(xì)胞爬片行HSP70的免疫組化染色，觀察熱療前后HSP70的不同表達(dá)。結(jié)果 未加熱細(xì)胞僅有少量HSP70的表達(dá)，隨加熱時(shí)間延長(zhǎng)，HSP70的表達(dá)逐漸增多；加熱后不同間隔HSP70的表達(dá)不同，間隔6 h HSP70的表達(dá)強(qiáng)，隨后逐漸減少，5-6天后，恢復(fù)至未加熱狀態(tài)。結(jié)論 ①溫和加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可誘導(dǎo)HSP70的大量產(chǎn)生，從而使腫瘤細(xì)胞對(duì)熱療產(chǎn)生熱耐受作用; ②卵巢癌HO-8910細(xì)胞對(duì)加熱有較強(qiáng)的耐受性。
關(guān)鍵詞：熱休克蛋白70；免疫組織化學(xué)；熱耐受；卵巢癌；
隨著科學(xué)技術(shù)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展，對(duì)癌癥的診斷和治療有了長(zhǎng)足的進(jìn)步。高溫治療也稱熱療（hyperthermia，HT，又叫溫?zé)岑煼ǎ?以其無(wú)手術(shù)痛苦、無(wú)術(shù)后并發(fā)癥及無(wú)化療及放療帶來(lái)的副反應(yīng)而發(fā)展成為癌癥治療的有一種有效方法[1]。高溫可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡或者生長(zhǎng)抑制，同時(shí)高溫還可提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療和放療的敏感性，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞對(duì)于高溫的敏感性明顯高于正常細(xì)胞。但在應(yīng)用過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)，隨熱療重復(fù)次數(shù)的增加，熱療效果反而下降，會(huì)出現(xiàn)所謂“熱耐受（thermotolerance）”現(xiàn)象，即第1次加溫可影響第2次加溫的生物學(xué)效應(yīng)。這說(shuō)明在熱療過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞內(nèi)生成了某些物質(zhì)可降低其對(duì)熱的敏感性。研究表明[2]，該現(xiàn)象與熱休克蛋白家族尤其與熱休克蛋白70（HSP70）的關(guān)系密切。本研究利用人卵巢癌細(xì)胞HO-8910受熱后進(jìn)行HSP70免疫組化染色，以了解在該細(xì)胞中HSP70的表達(dá)與加熱之間的關(guān)系。 
1 材料和方法
1.1 材料 人卵巢癌細(xì)胞系HO-8910為分化差的卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞，由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供。HSP70成套免疫組化試劑盒（產(chǎn)品編號(hào) SA2077）及DAB顯色試劑盒（產(chǎn)品編號(hào) ED1022）均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。
1.2 方法 
1.2.1 加熱處理 將細(xì)胞接種于含熱滅活的15%小牛血清及雙抗的RPMI1640 (Gibco BRL,USA) 培養(yǎng)液中，常規(guī)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為1×105/ml。將1cm×1cm 大小的蓋玻片置于24孔板中 ，每孔加入1ml的細(xì)胞懸液，制成細(xì)胞爬片。12 h后，將24孔板置于42℃培養(yǎng)箱中分別進(jìn)行兩種實(shí)驗(yàn)處理：①加熱時(shí)間分別設(shè)6個(gè)時(shí)間點(diǎn)，即15、30、60、90、120和150 min，加熱后的細(xì)胞即刻用0.01M PBS洗滌2次 ，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞40 min，制成細(xì)胞爬片后置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫虎趯⒓?xì)胞加熱120 min后，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中復(fù)溫不同時(shí)間，收集復(fù)溫后1、4、6、12、24、48、72、96、120及144 h后的細(xì)胞爬片按照上述步驟處理細(xì)胞固定后備用 。
1.2.2 HSP70表達(dá)的免疫組化染色檢測(cè) 將細(xì)胞爬片置于3% H2O2中室溫孵育10 min，以蒸餾水洗滌后次滴加正常山羊血清封閉液室溫放置20 min、滴加小鼠抗HSP70的抗體37℃ 1 h、滴加二抗及試劑SABC室溫下各放置20 min，后以 DAB顯色, 染色時(shí)間統(tǒng)一設(shè)為5 min后終止。再經(jīng) 蘇木素輕度復(fù)染、常規(guī)脫水、透明和封片后，于顯微鏡下觀察并照相。陽(yáng)性細(xì)胞胞漿/胞核染成棕黃色。
1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用等級(jí)資料的秩和檢驗(yàn)
2 結(jié) 果
① 在42℃條件下，加熱不同時(shí)間，卵巢癌細(xì)胞HO-8910細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)見表1。未加熱的細(xì)胞內(nèi)(見圖1A), 有少量的HSP70表達(dá)，表現(xiàn)為胞漿內(nèi)有極淡的淡黃染色；當(dāng)42℃加溫15 min時(shí)，細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)與正常細(xì)胞相比較無(wú)明顯改變；加熱30 min后 (見圖1 ，可見胞漿內(nèi)HSP70的染色略增強(qiáng)，但顏色仍較淡，于胞漿，但胞漿染色數(shù)量增加；無(wú)胞核染色；加溫60 min時(shí)(見圖1C)，可見胞漿內(nèi)HSP70的表達(dá)增強(qiáng)，表現(xiàn)為胞漿染色加深呈深黃色，染色細(xì)胞接近100%，但未見核染色；加溫90 min時(shí)(見圖1D)，胞漿內(nèi)染色進(jìn)一步加強(qiáng)呈棕黃色，偶爾可見核染色；加溫120 min時(shí)(見圖1E)，胞漿內(nèi)染色表現(xiàn)為明顯的棕黃色，核染色的細(xì)胞增多；加溫150 min時(shí)(見圖1F)，胞漿內(nèi)呈深棕黃色，核染色細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步增多。
表1 HO-8910細(xì)胞溫和加熱不同時(shí)間的免疫組化染色
組別 例數(shù) 染色分級(jí) 胞漿染色的細(xì)胞數(shù) 核染色的細(xì)胞數(shù)
組 10 Ⅰ（淡黃色） 40%～50% 0
第二組 15 Ⅰ（淡黃色） 40%～50% 0
第三組 20 Ⅰ（淡黃色） 80%～90% 0
第四組 20 Ⅱ（深黃色） 100% 0
第五組 20 Ⅲ（棕黃色） 100% 5%
第六組 20 Ⅲ（棕黃色） 100% 10%～15%
第七組 20 Ⅳ（深棕黃色） 100% 20%～30%
※ P<0.05
注：①組為未加熱細(xì)胞；第二組為42℃加熱15 min；第三組為42℃加熱30 min；第四組為42℃加熱60 min；第五組為42℃加熱90min；第六組為42℃加熱120min；第七組為42℃加熱120min
②免疫組化細(xì)胞染色分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)——淡黃色Ⅰ級(jí)；深黃色Ⅱ級(jí)；棕黃色Ⅲ級(jí)；深棕黃色Ⅳ級(jí)
② HO-8910細(xì)胞加熱120 min后，間隔不同時(shí)間進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果表明, 加熱后1 h，細(xì)胞染色呈深棕黃色仍保持強(qiáng)陽(yáng)性（Ⅳ級(jí)），未見明顯淡化；加熱后4 h（見圖2A），在所有染色的細(xì)胞爬片中，細(xì)胞染色表現(xiàn)為強(qiáng)Ⅳ級(jí)，核染色的細(xì)胞約占50%；加熱后6 h，幾乎維持原水平；加熱后12 h，可見胞漿染色有所淡化呈Ⅲ級(jí)棕黃色，但核染色未見明顯減少(見圖2 ；加熱后24 h，染色程度呈Ⅲ級(jí)，染色細(xì)胞數(shù)量仍保持100%，但胞核染色明顯減少，(見圖2C)；加熱后48 h，核染色全部消失，胞漿染色明顯變淡呈Ⅱ級(jí)深黃色(見圖2D)；72 h后，HSP70的表達(dá)進(jìn)一步減少，細(xì)胞染色呈黃色（圖 2E），隨后，細(xì)胞染色每隔24 h即有明顯淡化趨勢(shì)，120 h后，細(xì)胞恢復(fù)至正常狀態(tài)。
3 討 論
腫瘤熱療學(xué)是近20年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的一門新興學(xué)科，為腫瘤患者的治療帶來(lái)了一線生機(jī)[3]。在臨床應(yīng)用過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞可出現(xiàn)對(duì)熱的耐受現(xiàn)象，尤其是當(dāng)加熱溫度低于43℃（溫和熱療）或加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，更易發(fā)生熱耐受[4]。熱耐受不是細(xì)胞固有的特性、不遺傳，是一種暫時(shí)現(xiàn)象，可能是熱療過(guò)程中腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的某些物質(zhì)降低了其對(duì)熱的敏感性。研究表明，腫瘤細(xì)胞在熱應(yīng)激發(fā)生后，根本的變化是蛋白質(zhì)譜的改變，表現(xiàn)為合成了一組特殊的高度保守的蛋白質(zhì)——HSP或稱為應(yīng)激蛋白[5]，而正常蛋白質(zhì)合成卻被抑制。HSP是高熱誘導(dǎo)的一種適應(yīng)性蛋白，屬于一種分子伴侶，主要功能在于當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，可糾正新合成蛋白質(zhì)的折疊和空間構(gòu)象錯(cuò)誤，協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)，抵抗應(yīng)激原引起的變性，維持生理平衡，從而降低高熱誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[6]。HSP70在HSP家族的眾多成員中,是出色的熱耐受預(yù)測(cè)因子[7]。加熱過(guò)程中，伴隨HSP70水平的升高，正常蛋白質(zhì)的合成受到不同程度的抑制。加溫后半小時(shí)無(wú)蛋白質(zhì)的合成，隨著HSP70的產(chǎn)生，蛋白質(zhì)的生物合成逐漸恢復(fù)，腫瘤細(xì)胞的自我保護(hù)機(jī)制開始啟動(dòng)，從而引起腫瘤細(xì)胞對(duì)熱的敏感性下降。
卵巢癌是威脅女性健康的生殖器三大惡性腫瘤之一，死亡率高，5年生存率不到50%。由于耐藥及抵抗放療效果的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)，為卵巢癌的治療帶來(lái)了新問(wèn)題。隨著熱療學(xué)理論的日趨成熟，已有研究將其應(yīng)用于卵巢癌的臨床治療[8]。為了更好的將這一理論應(yīng)用于臨床，有必要了解卵巢癌細(xì)胞對(duì)熱療的敏感性。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：① 人卵巢癌細(xì)胞HO-8910在未加熱狀態(tài)下，即有少量的HSP70表達(dá)，當(dāng)給予溫和加熱（即加熱溫度為42℃）時(shí)，短時(shí)間內(nèi)，誘導(dǎo)產(chǎn)生的HSP70未見明顯增加。加熱時(shí)間≥60 min后，尤其是加熱時(shí)間超過(guò)120 min后，HSP70的表達(dá)明顯增加，表現(xiàn)為隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)而胞漿的染色加深，而且核染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，這一結(jié)果表明細(xì)胞的熱耐受已啟動(dòng)。②當(dāng)細(xì)胞受熱120 min后，停止加熱，在初的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)（1～4 h），HSP70的表達(dá)保持加熱當(dāng)時(shí)的水平，4 h后，HSP70的生成達(dá)高峰，表現(xiàn)為染色程度強(qiáng)，核染色細(xì)胞數(shù)量多，說(shuō)明此時(shí)細(xì)胞對(duì)熱的敏感性差。如再次加熱，高溫對(duì)該細(xì)胞的細(xì)胞毒作用低。此后，隨著時(shí)間的推移，HSP70的表達(dá)明顯減少，5～6 d后恢復(fù)至正常水平。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果還可看出，卵巢癌細(xì)胞HO-8910 對(duì)HSP70的表達(dá)有一定的時(shí)間依賴性，這也是臨床上腫瘤熱療間隔需3～4 d的原因之一。此外，雖然可通過(guò)提高加熱溫度來(lái)減少HSP70的表達(dá)，但畢竟39℃～42℃的溫度對(duì)于人體來(lái)說(shuō)是能夠承受的溫度，因而，可考慮通過(guò)抑制熱療過(guò)程中HSP的生成而提高熱療的效率，國(guó)外已有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道[9]。
一般而言，腫瘤細(xì)胞受熱溫度偏低，時(shí)間越長(zhǎng)，越易形成熱耐受[10]。人卵巢癌細(xì)胞HO-8910細(xì)胞在受熱60 min后，就已有明顯的HSP70的表達(dá)，而該細(xì)胞的恢復(fù)過(guò)程時(shí)間卻長(zhǎng)達(dá)5～6 d，這就提示我們腫瘤細(xì)胞對(duì)加熱有一定程度的耐受性，而且熱耐受因細(xì)胞不同而有不同的表現(xiàn)[11]，因此，在臨床應(yīng)用過(guò)程中需要考慮到這一要素。

◆ 細(xì)胞壞死與細(xì)胞凋亡
細(xì)胞凋亡與壞死是兩種*不同的細(xì)胞凋亡形式，根據(jù)死亡細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)上的差別，可以將二者區(qū)別開來(lái)。細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法有很多，下面介紹幾種常用的測(cè)定方法。 
一、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè) 
根據(jù)凋亡細(xì)胞固有的形態(tài)特征，人們已經(jīng)設(shè)計(jì)了許多不同的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法。
1 光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡
（1） 未染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞的體積變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期可見凋亡小體。
貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。
（2） 染色細(xì)胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割
成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。
2 熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡
一般以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變?yōu)橹笜?biāo)來(lái)評(píng)判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況。
常用的DNA特異性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三種染料與 DNA的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時(shí)發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光。
Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料，儲(chǔ)存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用時(shí)用PBS稀釋成終濃度為2~5mg/ml。
DAPI為半通透性，用于常規(guī)固定細(xì)胞的染色。儲(chǔ)存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用終濃度一般為0.5 ~1mg/ml。
結(jié)果評(píng)判：細(xì)胞凋亡過(guò)程中細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期：Ⅰ期的細(xì)胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體(圖1)。
3 透射電子顯微鏡觀察
結(jié)果評(píng)判：凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象（cavitations）的空泡結(jié)構(gòu)(圖2)；Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；細(xì)胞凋亡的晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。 

二、磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法） 
磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中(圖3)。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進(jìn)行熒光素（FITC、PE）或biotin標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來(lái)。
方法 
1 懸浮細(xì)胞的染色：將正常培養(yǎng)和誘導(dǎo)凋亡的懸浮細(xì)胞（0.5~1×106）用PBS洗2次，加入100ul Binding Buffer和FITC標(biāo)記的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室溫避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反應(yīng)5min后，加入400ul Binding Buffer，立即用FACScan進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)（一般不超過(guò)1h）， 同時(shí)以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作為陰性對(duì)照。
2 貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗滌、染色和分析同懸浮細(xì)胞。
3 爬片細(xì)胞染色：同上，后用熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡進(jìn)行觀察。
結(jié)果 [圖4、圖5]
注意事項(xiàng) 
1. 整個(gè)操作動(dòng)作要盡量輕柔，勿用力吹打細(xì)胞。
2. 操作時(shí)注意避光，反應(yīng)完畢后盡快在一小時(shí)內(nèi)檢測(cè)。

三、線粒體膜勢(shì)能的檢測(cè) 
線粒體在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著樞紐作用，多種細(xì)胞凋亡刺激因子均可誘導(dǎo)不同的細(xì)胞發(fā)生凋亡，而線粒體跨膜電位DYmt的下降，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中早發(fā)生的事件，它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂）出現(xiàn)之前，一旦線粒體DYmt崩潰，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。
線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽(yáng)離子熒光染料如Rhodamine 123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide[DiOC6（3）]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide[JC-1]、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強(qiáng)或減弱說(shuō)明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低。
方法：將正常培養(yǎng)的細(xì)胞和誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞加入使用終濃度為Rhodamine 123（1mM）或終濃度為DiOC6（25nM），JC-1（1mM），TMRM（100nM），37°C平衡30min，流式細(xì)胞計(jì)檢測(cè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。
注意事項(xiàng)
1． 始終保持平衡染液中pH值的一致性，因?yàn)閜H值的變化將影響膜電位。
2． 與染料達(dá)到平衡的細(xì)胞懸液中如果含有蛋白，他們將與部分染料結(jié)合，降低染料的濃度，引起假去極化。

四、DNA斷化檢測(cè) 
細(xì)胞凋亡時(shí)主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮, 染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂, 形成50~300kbp長(zhǎng)的DNA大片段, 或180~200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段, 在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNA ladder)。細(xì)胞經(jīng)處理后，采用常規(guī)方法分離提純DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細(xì)胞群中可觀察到典型的DNA ladder。如果細(xì)胞量很少，還可在分離提純DNA后，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）使DNA標(biāo)記，然后進(jìn)行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細(xì)胞中DNA ladder的形成。
1. 大分子染色體DNA段的測(cè)定
細(xì)胞凋亡的早期,染色體斷裂成為50~300kbp長(zhǎng)的DNA大片段。所有超過(guò)一定分子量大小的雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠中的遷移速度相同。線性DNA的雙螺旋半徑超過(guò)凝膠半徑時(shí)，即達(dá)到分辨力的極限。此時(shí)凝膠不再按分子量的大小來(lái)篩分DNA，DNA像通過(guò)彎管一樣，以其一端指向電場(chǎng)一極而通過(guò)凝膠，這種遷移模式稱之為"爬行"。因此，細(xì)胞凋亡早期產(chǎn)生的50~300kbp長(zhǎng)的DNA大片段不能用普通的瓊脂糖凝膠電泳來(lái)分離。通常采用脈沖電泳技術(shù)可圓滿地解決這一問(wèn)題。這個(gè)方法是在凝膠上外加正交的交變脈沖電場(chǎng)。每當(dāng)電場(chǎng)方向改變后，大的DNA分子便滯流在爬行管中，直至新的電場(chǎng)軸向重新定向后，才能繼續(xù)向前移動(dòng)。DNA分子量越大，這種重排所需要的時(shí)間就越長(zhǎng)。當(dāng)DNA分子變換方向的時(shí)間小于電脈沖周期時(shí)，DNA就可以按其分子量大小分開。
參考文獻(xiàn) Brown,D.G., Sun, X.M., and Cohen, G.M.(1993) Dexamethasone-induced apoptosis involves cleavage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. Biol.Chem. 268, 3037-3039
2． DNA Ladder 測(cè)定
方法：收獲細(xì)胞（1′107）沉淀?細(xì)胞裂解液?13000rpm′5min, 收集上清?1%SDS和RnaseA（5mg/ml）56°C，
2h?蛋白酶K（2.5mg/ml）37°C，2h?1/10體積3M醋酸鈉和2.5倍體積的冷無(wú)水乙醇沉淀DNA，4°C過(guò)夜?14000rpm′15min?后將沉淀溶解在TE buffer中，加DNA Loading Buffer?1.2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色并照相。
結(jié)果：[圖6]
參考文獻(xiàn) Herrmannm M, Lorenz HM, Voll R et al. A Rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments. Nucleic Acid Res. 1994; 22:5506-5507
3． 凋亡細(xì)胞DNA含量的流式細(xì)胞計(jì)分析
方法：收集細(xì)胞?70%冷乙醇（in PBS）4°C固定過(guò)夜?PBS洗滌，1000rpm′10min?RNase A（0.5mg/ml）37°C消化30min?PI（50mg/ml）染色，室溫避光15min?FACScan分析DNA亞二倍體的形成及細(xì)胞周期的變化。
結(jié)果：[圖7]
4. ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay (CLONTECH)
優(yōu)點(diǎn)：敏感度高，適合于檢測(cè)少量樣本，小部分凋亡細(xì)胞。如臨床活組織檢測(cè)。

五 TUNEL法 
細(xì)胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3'-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒(méi)有DNA的斷裂，因而沒(méi)有3'-OH形成，很少能夠被染色。TUNEL實(shí)際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)測(cè)定，并可檢測(cè)出極少量的凋亡細(xì)胞，因而在細(xì)胞凋亡的研究中被廣泛采用。 

六、Caspase-3活性的檢測(cè) 
Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個(gè)大亞基（17KD）和兩個(gè)小亞基（12KD）組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞，caspase-3的活性明顯下降。
1 Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及對(duì)底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。
方法：
收集細(xì)胞→PBS洗滌→抽提細(xì)胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE電泳→硝酸纖維素膜或PVDF膜轉(zhuǎn)移→5%脫脂奶粉封閉，室溫1.5~2h或4°C過(guò)夜→Caspase-3多抗或單抗室溫反應(yīng)1~2h或4°C過(guò)夜→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，5~10min/次→HRP-標(biāo)記的羊抗鼠IgG或AP標(biāo)記的羊抗鼠IgG室溫反應(yīng)1~2h→ TBS-T洗3次， 5~10min/次?→ECL顯影或NBT/BCIP顯色。
結(jié)果：[圖8-1、圖8-2]
2 熒光分光光度計(jì)分析
原理：活化的Caspase-3能夠特異切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽鍵。根據(jù)這一特點(diǎn)，設(shè)計(jì)出熒光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽Ac-DEVD-AMC。在共價(jià)偶聯(lián)時(shí)，AMC不能被激發(fā)熒光，短肽被水解后釋放出AMC，自由的AMC才能被激發(fā)發(fā)射熒光。根據(jù)釋放的AMC熒光強(qiáng)度的大小，可以測(cè)定caspase-3的活性，從而反映Caspase-3被活化的程度。
方法：收獲細(xì)胞正常或凋亡細(xì)胞?PBS洗滌?制備細(xì)胞裂解液?加Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽熒光底物）?37°C反應(yīng)1h?熒光分光光度計(jì)（Polarstar）分析熒光強(qiáng)度（激發(fā)光波長(zhǎng)380nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為430-460nm）。
結(jié)果：[圖9]
3 流式細(xì)胞術(shù)分析
方法：收獲細(xì)胞正常或凋亡細(xì)胞?PBS洗滌?加Ac-DEVD-AMC?37°C反應(yīng)1h?UV流式細(xì)胞計(jì)分析caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和平均熒光強(qiáng)度。
結(jié)果：[圖10]

七、凋亡相關(guān)蛋白TFAR19蛋白的表達(dá)和細(xì)胞定位分析 
TFAR19（PDCD5）是由本研究室在上首先報(bào)導(dǎo)的一個(gè)擁有自己知識(shí)產(chǎn)權(quán)的人類新基因，前期的功能研究表明，它是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的增強(qiáng)劑。利用熒光素（FITC）標(biāo)記的TFAR19單克隆抗體為探針，對(duì)細(xì)胞凋亡過(guò)程中TFAR19蛋白的表達(dá)水平及定位研究發(fā)現(xiàn)，凋亡早期TFAR19表達(dá)水平增高并出現(xiàn)快速核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，伴隨著細(xì)胞核形態(tài)學(xué)的變化，持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間，在凋亡小體中仍然可見。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，凋亡早期TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位早于磷脂酰絲氨酸（PS）外翻和細(xì)胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位是細(xì)胞凋亡更早期發(fā)生的事件之一。進(jìn)一步的研究證明，凋亡早期TFAR19的核轉(zhuǎn)位具有普遍意義，不同細(xì)胞凋亡早期均出現(xiàn)TFAR19高表達(dá)和核轉(zhuǎn)位。這為研究細(xì)胞凋亡早期所發(fā)生的事件，提供了一種新的技術(shù)和指標(biāo)。
（一）TFAR19蛋白的細(xì)胞定位分析
材料試劑：
FITC標(biāo)記的單克隆抗體，pH7.4 、0.15Mol/L PBS，3%的多聚甲醛，PBS-T（pH7.4 、0.15Mol/L PBS 含0.2% Tween 20），胎牛血清，熒光細(xì)胞洗液：pH7.4 、0.15Mol/L PBS含2%胎牛血清及0.1%NaN3 。FACS管，Tip頭，移液器。
儀器：低溫水平離心機(jī), 37°C水浴箱，熒光顯微鏡，共聚焦激光掃描顯微鏡，流式細(xì)胞計(jì)
方法：
1 懸浮細(xì)胞的染色：
（1）收獲正常和誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞（0.5~1′106），PBS洗2次，1000rpm′10min。
（2）3%多聚甲醛冰浴10min，PBS洗2次，1000rpm′10min。
（3）加入PBS-T溶液，37°C孵育15min，PBS洗2次，1000rpm′10min。
（4）加入200ml胎牛血清，室溫反應(yīng)30min。
（5）加入5ml FITC標(biāo)記的TFAR19單抗（終濃度為1：40），4°C反應(yīng)30min
（6）熒光細(xì)胞洗液洗2次，1000rpm′10min。
結(jié)果觀察：將細(xì)胞沉淀滴片，熒光顯微鏡及共聚焦激光顯微鏡下觀察TFAR19在細(xì)胞中的定位。同時(shí)用流式細(xì)胞計(jì)定量檢測(cè)TFAR19蛋白的平均熒光強(qiáng)度。[圖11]
2：貼壁細(xì)胞的原位染色
（1） 貼壁生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期細(xì)胞鋪在24孔或6孔板中（內(nèi)有潔凈蓋玻片），讓其爬片生長(zhǎng)，待長(zhǎng)到
50%~80%滿時(shí)，凋亡誘導(dǎo)劑處理細(xì)胞。
（2） 將不同時(shí)間點(diǎn)處理的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，染色步驟同上。
（3） 將染色的爬片細(xì)胞放于一張滴有少量甘油（5ml）的載玻片上，熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描顯微
鏡觀察TFAR19在細(xì)胞中的定位。
結(jié)果觀察：[圖12]
3：臨床病理切片的染色、檢測(cè)。
4：原代細(xì)胞的培養(yǎng)、檢測(cè)。
5：分析TFAR19蛋白在人體內(nèi)各組織器官的分布及定位
（二）TFAR19蛋白的表達(dá)與臨床疾病
1． ELISA法檢測(cè)正常人和疾病狀態(tài)下，以及疾病的不同時(shí)期，血清中TFAR19蛋白水平及其TFAR19自身抗體水平。
材料和試劑：
1. 包被Buffer: pH9.6, 0.05Mol/L碳酸鹽Buffer
2. 洗滌液： pH7.4, 0.15Mol/L PBS 含0.05% Tween 20
3. 封閉液： 3%BSA（用洗滌液配制）
4. 酶標(biāo)抗體的稀釋：用封閉液稀釋
5. OPD底物Buffer：Na2HPO4.12H2O 1.84g
檸檬酸 0.51g 
DDW 100ml
6. 顯色液（現(xiàn)配現(xiàn)用）：底物Buffer 10ml
OPD 2mg
30% H2O2 2ml
7. 終止液 2Mol/L H2SO48. 重組人TFAR19, HRP標(biāo)記的羊抗人IgG9. ELISA板, Tip, 移液器，ELISA 
Reader（OD490nm），洗板機(jī) 
操作步驟
1. 用包被Buffer稀釋的重組人TFAR19（1mg/ml）包被ELISA板, 100ml/well, 37°C孵育2h或4°C過(guò)夜（一般24h以上）。
2. 洗滌Buffer洗板三次，加入封閉液，200 ml/well ， 37°C孵育2h或4°C
過(guò)夜。
3. 洗滌Buffer洗板三次，加入不同稀釋度的病人血清（3個(gè)重復(fù)孔）100ml/well ，37°C孵育1h。設(shè)包被Buffer、洗滌Buffer 、封閉液為陰性對(duì)照。
4. 洗滌Buffer洗板三次，加入1：2500稀釋的HRP標(biāo)記的抗人IgG, 100ml/well，37°C孵育1h。
5. 洗滌Buffer洗板三次，加入顯色液，100 ml/well，避光反應(yīng)10~15min。
6. 加入H2SO4終止反應(yīng)，50 ml/well。
7. ELISA Reader 讀取OD490 光密度值，分析和比較病人血清和正常血 清中TFAR19自身抗體的表達(dá)水平。

2． Western blot 分析原發(fā)性腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的TFAR19蛋白的表達(dá)水平。

◆ 細(xì)胞凋亡與肝病（一篇綜述）

摘要：細(xì)胞凋亡是能量依賴的細(xì)胞內(nèi)死亡程序活化而致的細(xì)胞。細(xì)胞凋亡偏重于凋亡小體的形態(tài)學(xué)的變化過(guò)程，并且可見于許多非生理狀態(tài)，如疾病所引起的細(xì)胞凋亡和抗癌藥物所引起的癌細(xì)胞死亡等，而程序性細(xì)胞死亡則偏重于其分子生物學(xué)和生理性功能，一般指生理性死亡。近年來(lái)有關(guān)肝病凋亡的論文發(fā)表量日益增多，本文就此進(jìn)行綜述。
一 、細(xì)胞凋亡的特征和檢測(cè)方法
細(xì)胞凋亡在形態(tài)學(xué)上有四大特征：1）、細(xì)胞變圓，2）、胞漿起泡，3）、核固縮，4）、凋亡小體形成。形態(tài)學(xué)觀察到凋亡小體是細(xì)胞凋亡的金標(biāo)準(zhǔn)，但此法并不敏感。（1）瓊脂糖凝膠電泳對(duì)凋亡細(xì)胞基因組進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)其DNA段呈180-200bp的階梯狀的電泳條帶。檢測(cè)出這種典型的電泳條帶是細(xì)胞凋亡的可靠指標(biāo)。（2）近年來(lái)用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡的技術(shù)還有 TUNEL 法，通常認(rèn)為其對(duì)細(xì)胞凋亡數(shù)量的估計(jì)過(guò)高。（3）因此在研究細(xì)胞凋亡時(shí)應(yīng)盡可能的做瓊脂糖凝膠電泳作為對(duì)照。另外還有流式細(xì)胞儀法測(cè)凋亡細(xì)胞峰法，通常認(rèn)為它可以測(cè)定細(xì)胞凋亡的數(shù)量，并能夠?qū)乃兰?xì)胞、活細(xì)胞區(qū)分開來(lái)，是一種比較好的檢測(cè)方法。可進(jìn)行定量半定量的分析。（4） 
在肝臟凋亡小體被認(rèn)為就是Councilman 小體、嗜酸性小體和固縮壞死。（5）并且發(fā)現(xiàn)肝臟凋亡發(fā)生迅速，可在幾分鐘、幾小時(shí)內(nèi)完成。通常凋亡細(xì)胞的清除是一個(gè)不伴有炎癥的過(guò)程，因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)的內(nèi)容物被膜包裹形成凋亡小體而被枯否細(xì)胞、臨近的肝細(xì)胞清除，細(xì)胞內(nèi)的酶不外溢。這通常是對(duì)的，然而肝細(xì)胞的凋亡并非人們所想象的那樣隱蔽而不容易被發(fā)現(xiàn)，在肝細(xì)胞的凋亡過(guò)程中可以檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)酶，并且當(dāng)?shù)蛲龅母渭?xì)胞的數(shù)量超過(guò)肝組織的清除能力時(shí)，組織結(jié)構(gòu)的丟失將會(huì)發(fā)生炎癥，因此細(xì)胞凋亡在過(guò)去認(rèn)為由細(xì)胞壞死觸發(fā)的許多疾病中可能起重要作用。（6）
二、細(xì)胞凋亡的機(jī)制
在凋亡的過(guò)程中，凋亡啟動(dòng)階段可以與凋亡執(zhí)行階段區(qū)分開來(lái)，在執(zhí)行階段 Caspases( 一組新的特異性水解底物天冬氨酸殘基的半胱氨酸蛋白酶家族)，可以依次激活來(lái)水解細(xì)胞和裂解一些關(guān)鍵的蛋白。Caspases通常以酶原Procaspases的形式存在于細(xì)胞胞漿內(nèi)，需要蛋白酶先將其裂解為有功能的蛋白酶的形式才可發(fā)揮作用。并且現(xiàn)在認(rèn)為Procaspases具有Caspases的活性，但其活性較Caspases為低。如Procaspase-8具有活化Caspase-8 1%~2%的活性。所以Procaspase-8相互聚集時(shí)可以自我激活或相互激活為Caspase-8。Procaspases的相互聚集可由結(jié)合調(diào)節(jié)分子介導(dǎo),如CARDs(caspases recruitment domains) 和DEDs(death effector domains)，CARDs和DEDs與Fas 和p75NGF 受體死亡區(qū)域具有相似的結(jié)構(gòu)（6個(gè)折疊閉環(huán)，兩歧性反向平行的α螺旋）。因此Procaspases可以相互聚集形成“apoptosome”來(lái)激活 Caspases。之后Caspases可將蛋白從天冬氨酸鹽羥基端一分為二。同時(shí)Caspases自身也是通過(guò)對(duì)其天冬氨酸殘基進(jìn)行裂解而激活。通常認(rèn)為Caspases是通過(guò)其他的Caspases的裂解而激活。Caspases激活Caspases的過(guò)程會(huì)導(dǎo)致Caspases的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)。Caspases(-3，-6，-7)被認(rèn)為是Caspases中下游的Caspases，并且是分解底物的關(guān)鍵酶，是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者。近來(lái)已發(fā)現(xiàn)兩條激活Caspases的通路。一條涉及到死亡因子和死亡受體，另一條與線粒體功能障礙有關(guān)。(7)
死亡受體是腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）超家族的成員。到目前為止共發(fā)現(xiàn)8種死亡受體，其中TNF受體1（TNF receptor-1,TNF-R1）和Fas（又稱CD95/APO-1）白被研究的多，它們均通過(guò)其配體而被激活起作用。Fas和TNF-α可以動(dòng)員細(xì)胞內(nèi)不同的死亡復(fù)合體伴隨的調(diào)節(jié)蛋白和procaspases 而活化死亡復(fù)合體，然后由死亡復(fù)合體激活一系列的上游Caspases，主要的是Caspase-8,由它激活下游的Caspases 蛋白酶來(lái)執(zhí)行促使細(xì)胞凋亡的作用。(7、8)
在第二條通路，細(xì)胞應(yīng)激可以促發(fā)細(xì)胞色素C從線粒體上脫落，這通常可能是通過(guò)線粒體內(nèi)膜的通透性改變而介導(dǎo)的。脫落的細(xì)胞色素C與 Apaf-1結(jié)合后而激活Caspase-9, Caspase-9然后激活下游的Caspases執(zhí)行促使細(xì)胞凋亡的作用。(7)近來(lái)的資料表明線粒體和死亡復(fù)合體可以通過(guò)Bid蛋白聯(lián)系起來(lái)，Caspase-8激活Bid蛋白，Bid蛋白隨后可以誘導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素C。Bid 蛋白是Bcl-2家族的一員。目前還發(fā)現(xiàn)其它幾種胞漿蛋白參與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)，主要是 Bcl-2的家族成員。目前在哺乳動(dòng)物中已鑒定出至少１５種Bcl-2蛋白。它們可以分成兩大類：促進(jìn)細(xì)胞凋亡的，如Bax、Bak、Bok Bcl-xS、Bag、Bid、Hrk、BNIP3、BimL、EGL、Blk和Bad；抑制細(xì)胞凋亡的，如Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1、Bfl-1、Brg-1、和A1。(9,10)促進(jìn)和抑制細(xì)胞凋亡的Bcl-2家族成員能結(jié)伴形成同源或異源二聚體。抗細(xì)胞凋亡的Bcl-2家族成員可以與線粒體結(jié)合抑制其釋放細(xì)胞色素C，發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用。(11)已有的研究表明當(dāng)Bcl-2/Bax>Bax/Bax時(shí)，細(xì)胞趨向于存活，當(dāng)Bcl-2/Bax三、細(xì)胞凋亡在肝病發(fā)病中的作用
１ 酒精性肝病
到目前為止僅有有限的關(guān)于細(xì)胞凋亡在酒精性肝病（alcoholic liver disease,ALD）發(fā)病中作用的報(bào)導(dǎo)。但是細(xì)胞凋亡在ALD發(fā)病中的作用卻日益明朗化。事實(shí)上凋亡在ALD中的表現(xiàn)形式是嗜酸性小體，而且凋亡的標(biāo)志物和Mallory小體可以在ALD 的肝細(xì)胞中同時(shí)觀察到，提示這些細(xì)胞在組織中是通過(guò)凋亡的形式被清除的。同時(shí)在實(shí)驗(yàn)性ALD也可發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞凋亡，長(zhǎng)期給予酒精的小鼠肝細(xì)胞內(nèi)可見凋亡小體的數(shù)量明顯增多，主要集中在肝小葉中央靜脈末端的周圍，這些病變?cè)诮K止酒精給予后可逆。另一研究表明伴有肝損傷（如脂肪肝或肝炎癥侵潤(rùn)）的酒精飼養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)量增加。潛在的肝病理狀態(tài)，使肝細(xì)胞更易于發(fā)生酒精誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡，這在肝鐵超負(fù)荷時(shí)可以見到，而肝鐵超負(fù)荷可見于許多酒精性肝病患者。在一個(gè)研究肝鐵影響的大鼠模型中，在這些動(dòng)物中凋亡細(xì)胞的數(shù)量超過(guò)了肝鐵儲(chǔ)積的作用，提示尚有其它的途徑參與肝細(xì)胞凋亡。
酒精導(dǎo)致得肝損傷被認(rèn)為與氧化應(yīng)激導(dǎo)致的活性氧中間產(chǎn)物有關(guān)。在急性酒精中毒導(dǎo)致谷胱甘肽缺乏的大鼠模型中可見到許多凋亡的肝細(xì)胞。伴隨著氧化應(yīng)激在酒精導(dǎo)致得肝損傷中的作用，抗氧化劑在同一動(dòng)物模型中可以減少凋亡細(xì)胞的數(shù)量。活性氧中間產(chǎn)物和脂質(zhì)過(guò)氧化的形成被認(rèn)為與細(xì)胞色素P450 2E1(CYP2E1)有關(guān)，而CYP2E1在肝細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá)。在導(dǎo)入CYP2E1表達(dá)的肝細(xì)胞中，由活性氧中間產(chǎn)物介導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化和隨后在那些富含花生四烯酸的肝細(xì)胞中可見到細(xì)胞凋亡。同樣通過(guò)導(dǎo)入Bcl-2可以阻止由CYP2E1介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡。另一研究在有明顯炎癥和脂質(zhì)過(guò)氧化的實(shí)驗(yàn)性ALD模型中發(fā)現(xiàn)Bcl-2 蛋白表達(dá)增加。因此肝細(xì)胞通過(guò)表達(dá)抗凋亡的Bcl-2蛋白可能是其抵抗酒精誘導(dǎo)的肝損傷的一種保護(hù)機(jī)制。
氧化應(yīng)激也被認(rèn)為與Fas系統(tǒng)相關(guān)，在酒精性肝損傷的病人中，肝細(xì)胞Fas配體mRNA轉(zhuǎn)錄增多，體內(nèi)Fas配體可能是由活性氧中間產(chǎn)物誘導(dǎo)產(chǎn)生的。由于肝細(xì)胞可表達(dá)Fas受體，這些發(fā)現(xiàn)提示肝細(xì)胞可能通過(guò)旁分泌或自分泌的機(jī)制來(lái)介導(dǎo)自身的死亡。這種由酒精誘導(dǎo)肝損傷的潛在尚未*闡明的重要機(jī)制被稱為“fractricide”.
其它的幾種細(xì)胞因子也可以參與酒精導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。纖維原性生長(zhǎng)因子，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)可誘導(dǎo)培養(yǎng)的肝細(xì)胞發(fā)生凋亡，在ALD的進(jìn)展中可能具有雙重作用：1）促進(jìn)纖維化，2）通過(guò)凋亡殺死細(xì)胞。另外TNF-α1活性在臨床ALD病人中和實(shí)驗(yàn)性ALD大鼠的肝細(xì)胞中表達(dá)均增強(qiáng)。慢性酒精消耗也可使肝細(xì)胞TNF-α1表達(dá)增加。總之，在慢性酒精消耗TNF-α1表達(dá)上調(diào)使肝細(xì)胞易于發(fā)生由這些細(xì)胞因子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，提示TNF-α1在ALD發(fā)病的病理生理中其重要作用。( 以上參考文獻(xiàn)2，6，12，13，14，15，16，17)
2 病毒性肝炎
研究表明肝細(xì)胞凋亡在病毒性肝炎中起重要作用。病理形態(tài)學(xué)研究表明人肝炎中的確存在死亡的凋亡細(xì)胞，事實(shí)上在病毒性肝炎中可以經(jīng)常觀察到肝細(xì)胞以凋亡的行式被清除掉，病毒感染伴隨凋亡被認(rèn)為是由細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（cytotoxic Tlymphocyte，CTL）作用的結(jié)果。CTL在識(shí)別病毒抗原是誘導(dǎo)自身表達(dá)Fas配體，并與靶細(xì)胞表面的Fas結(jié)合，啟動(dòng)凋亡信號(hào)，活化細(xì)胞死亡程序，使細(xì)胞死亡。已有的資料提示有幾種不同的凋亡通路參與了肝細(xì)胞的凋亡，包括Fas系統(tǒng)、TNF-α系統(tǒng)、Perforin/Granzyme系統(tǒng)。
對(duì)于細(xì)胞凋亡在病毒性肝炎中的作用僅有有限的資料。小樣本的資料研究表明在三例爆發(fā)性乙型病毒性肝炎中Fas蛋白表達(dá)增多。TUNEL分析表明大多數(shù)肝細(xì)胞呈陽(yáng)性，提示Fas系統(tǒng)介導(dǎo)的凋亡參與急性肝炎的發(fā)病。
HBV和HCV是慢性肝病的主要致病因素。這些病毒感染使肝細(xì)胞易于發(fā)生凋亡，也可以通過(guò)model和病毒蛋白抑制凋亡。例如在小鼠肝細(xì)胞系中，TNF-α只能誘導(dǎo)高度表達(dá)HBV的肝細(xì)胞發(fā)生廣泛的凋亡。感染HBV的肝細(xì)胞對(duì)促進(jìn)凋亡因素的敏感性增高被認(rèn)為與HBV的X-基因產(chǎn)物有關(guān)；同樣HCV感染的肝細(xì)胞，HCV的病毒核心蛋白可以與TNF-αR1的胞漿內(nèi)區(qū)域結(jié)合，這種相互作用在小鼠和人肝細(xì)胞株均可通過(guò)TNF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)介導(dǎo)而促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡。HBV、HCV感染肝細(xì)胞凋亡的敏感性增高的機(jī)制是不十分清楚的，但可能與TNF-αR1表達(dá)上調(diào)無(wú)關(guān)。為了完成自身的復(fù)制和阻止感染的肝細(xì)胞被清除，病毒同時(shí)發(fā)展了阻止凋亡的機(jī)制，這可以從HCV的NS3蛋白可抑制放線菌素誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡中得到例證。病毒蛋白對(duì)凋亡的總體作用似乎與凋望刺激物、細(xì)胞內(nèi)容物和不同的病毒蛋白表達(dá)的相對(duì)水平有關(guān)。
目前的臨床研究資料提示在HBV和HCV感染的肝細(xì)胞中有免疫介導(dǎo)的凋亡途徑激活。在慢性HCV感染的40位病人的肝組織中用免疫組化的方法研究發(fā)現(xiàn)其Fas 和HCV核心蛋白抗原的表達(dá)明顯高于健康者。在慢性HBV感染的病人也可以觀察到其Fas系統(tǒng)激活，并且Fas不但在肝細(xì)胞中高度表達(dá)，而且在分子水平上上調(diào)。有趣的是Fas mRNA主要在淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的區(qū)域被發(fā)現(xiàn)，這也支持CTL介導(dǎo)感染肝細(xì)胞通過(guò)Fas系統(tǒng)發(fā)生凋亡。因此人們推測(cè)以凋亡的形式清除肝細(xì)胞可能是：1）感染了肝炎病毒的肝細(xì)胞表面除了病毒抗原和MHCⅠ類抗原外，F(xiàn)as表達(dá)也增多。2）肝炎病毒抗原和MHCⅠ類抗原與CTL表面的T細(xì)胞受體結(jié)合，活化CTL誘導(dǎo)其表達(dá)Fas配體。3）表達(dá)于CTL表面的Fas配體與肝細(xì)胞表面的Fas結(jié)合，傳導(dǎo)死亡信號(hào)，激活caspases 等使肝細(xì)胞死亡。（以上參考文獻(xiàn)2，6，12，14，17，18，19，20）
3 膽汁淤滯性肝病
在許多臨床綜合征中可以觀察到膽汁淤滯，膽汁淤滯是一組慢性進(jìn)行肝病的主要特征，并可終導(dǎo)致肝硬化、肝衰竭和死亡。肝內(nèi)疏水的毒性膽鹽儲(chǔ)滯長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為是肝損傷的一個(gè)主要原因，并被認(rèn)為是膽汁淤滯性肝病肝損傷的一個(gè)關(guān)鍵原因。事實(shí)上肝內(nèi)毒性膽鹽：鵝脫氧膽酸和脫氧膽酸鹽的儲(chǔ)滯水平與肝損傷的程度呈正相關(guān)。在大多數(shù)膽汁淤滯性肝病中廣泛的壞死并不常見，因此細(xì)胞凋亡介導(dǎo)的肝細(xì)胞死亡在膽汁淤滯性肝病中遠(yuǎn)較細(xì)胞壞死為常見。如在原發(fā)性膽管性肝硬化的病人肝組織中凋亡的特征較對(duì)照組為明顯。毒性膽鹽誘發(fā)的凋亡近年來(lái)已被部分闡明。毒性膽鹽可誘導(dǎo)培養(yǎng)的嚙齒類動(dòng)物肝細(xì)胞發(fā)生凋亡，這可能是由非Fas配體依賴性途徑激活裂解激活Caspases-8，然后由其激活下游的Caspases導(dǎo)致肝細(xì)胞死亡。組織蛋白酶B（一種胱氨酸蛋白酶）在這種凋亡中起重要的作用，實(shí)際上胱氨酸蛋白酶被激活后被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)作為毒性膽鹽導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡的效應(yīng)物而起作用。毒性膽鹽誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡同時(shí)需要蛋白激酶C的激活和轉(zhuǎn)位，使細(xì)胞內(nèi)的鎂離子增多，激活鎂依賴性核酸內(nèi)切酶降解 DNA。然而非毒性的疏水膽鹽：熊去氧膽酸和一種毒性膽鹽同時(shí)加入培養(yǎng)的肝細(xì)胞內(nèi)，死亡的肝細(xì)胞減少。所以認(rèn)為熊去氧膽酸有抗凋亡的作用，這可能與其降低線粒體的通透性有關(guān)。因此抗凋亡作用可能是熊去氧膽酸在膽汁淤滯性肝病中發(fā)揮治療作用的重要機(jī)制。
對(duì)于Bcl-2在抗毒性膽鹽誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡的作用，已有人用膽道結(jié)扎的方法作為膽汁淤積的模型進(jìn)行研究，正常情況下肝細(xì)胞并不表達(dá)Bcl-2。然而在膽道結(jié)扎的小鼠中，可發(fā)現(xiàn)Bcl-2表達(dá)，提示這是肝細(xì)胞的一種適應(yīng)性機(jī)制來(lái)抵抗毒性膽鹽導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。在于膽汁分泌直接相關(guān)的膽管細(xì)胞中可發(fā)現(xiàn)Bcl-2的表達(dá)，進(jìn)一步支持這一看法。在原發(fā)性膽管性肝硬化病人的肝組織中也可發(fā)現(xiàn)Bcl-2表達(dá)。具有抗凋亡作用的Bcl-2表達(dá)被認(rèn)為可以阻止毒性膽鹽介導(dǎo)的肝損傷。（以上參考文獻(xiàn)2，6，12，14，18，19）
4 肝細(xì)胞腫瘤
上述所提到的肝病有一個(gè)共同的特點(diǎn)，既細(xì)胞凋亡的數(shù)量與正常對(duì)照組相比均提高，從而導(dǎo)致肝損傷。而在肝細(xì)胞腫瘤（hepatocelleular carcinoma，HCC）形成中損傷DNA和惡性細(xì)胞凋亡不足被認(rèn)為是一個(gè)決定性因素。研究表明在HCC多步形成機(jī)制中凋亡不足起重要的作用。有人分析22例HCC病人肝細(xì)胞發(fā)現(xiàn)Fas表達(dá)部分或全部缺失，而在健康的肝組織中可表達(dá)。另一研究表明Fas與HCC的分化程度有關(guān)：在低分化、門脈腫瘤栓塞、肝外浸潤(rùn)的HCC中，F(xiàn)as表達(dá)明顯降低，這些結(jié)果均支持Fas表達(dá)缺失是惡性腫瘤細(xì)胞逃避CTL細(xì)胞殺傷和促進(jìn)其生存的一條重要途徑。另一研究在給于不同的化療藥物治療后均有P-53依賴性Fas表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致的肝腫瘤細(xì)胞的凋亡增加,并且呈劑量依賴性。
TGF-β1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡異常被認(rèn)為是HCC 形成的又一重要的細(xì)胞因子。如前所述TGF-β1能夠誘導(dǎo)正常肝細(xì)胞發(fā)生凋亡。TGF-β1的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及兩種不同的受體：1型和2型。TGF-β1選擇性的與2型受體結(jié)合，之后與1型受體形成復(fù)合物，激活下游的的信號(hào)傳導(dǎo)。在HCC病人1型、2型受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平均明顯降低，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡異常。另一項(xiàng)研究提示盡管在HCC病人的肝細(xì)胞中有2型受體的表達(dá)，但彌散分布在胞漿內(nèi)，在細(xì)胞膜上不能檢測(cè)到。這些研究均提示肝細(xì)胞膜上TGF-β2型受體的表達(dá)缺陷是腫瘤細(xì)胞逃避TGF-β1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡而增殖的原因。
HCC的肝細(xì)胞凋亡數(shù)與P53蛋白的表達(dá)水平呈正相關(guān)，支持P53在腫瘤性肝損傷中參與腫瘤細(xì)胞凋亡。P53蛋白是一種腫瘤抑制基因，而其表達(dá)的P53蛋白是細(xì)胞DNA損傷后修復(fù)所不可少的。如果DNA不能修復(fù)，P53便誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。因此P53的功能不良使腫瘤細(xì)胞可逃避凋亡而不斷增殖。（以上參考文獻(xiàn)2，6，12，14，17，20，22，23，24。）
總之由以上分析可見，細(xì)胞凋亡在肝病發(fā)病的病理生理中起重要作用。細(xì)胞凋亡的增多涉及許多不同的介導(dǎo)因子，如Fas、TNF- α、TNF-β1和Bcl-2家族在許多不同的肝損傷中均可發(fā)揮作用，這些疾病包括病毒性肝炎、膽汁淤滯性肝病和酒精性肝病。在這些疾病中凋亡的減少可能是有益的，并是未來(lái)藥物發(fā)展的方向。 在另一方面，凋亡的調(diào)節(jié)異常使惡性的肝腫瘤細(xì)胞可避免被殺傷。對(duì)于HCC的預(yù)防和治療來(lái)說(shuō)特異地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是一個(gè)新的有價(jià)值的選擇。
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