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一、設(shè)備和試劑
1．設(shè)備
① 電泳電源
Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell,Mini Teans-Blot Module,and PowerPac Basic Power Supply (BIO-RAD,Catalog#165-3323)
② 電泳儀及附件
Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell (BIO-RAD,Catalog#165-3301)
③ 電轉(zhuǎn)儀及附件
Mini Teans-Blot Elecreophoresis Transfer Cell (BIO-RAD,Catalog#170- 3930)
④ NC膜
PIERCE，Catalog#88018
⑤ 濾紙
Whatman,3MM CHR

2.試劑
① 凝膠試劑
試劑名稱        廠家及規(guī)格
30%丙烯酰胺溶液        上海生工
Tris-Base        SIGMA
10%SDS        SIGMA
10%過(guò)硫酸銨        上海生工
TEMED        上海生工
② 常用溶液及緩沖液
A．5%積層膠所用溶液
B．分離膠溶液
C．電泳緩沖液，1L
3g Tris-Base、14.4g 甘氨酸、1g SDS，加蒸餾水至IL，pH應(yīng)該在8.3左右。也可以制成10×的儲(chǔ)存液，在室溫下長(zhǎng)期保存
D．電泳轉(zhuǎn)移緩沖液,1L
3g Tris-Base、14.4g 甘氨酸、甲醇200ml, 加蒸餾水至1L, 也可以制成10×的儲(chǔ)存液，在濕溫下長(zhǎng)期保存
E．5×樣品緩沖液,10ml
0.6ml 1mol/L的Tris-HCl（Ph6.8）、5ml 50%的甘油、2ml 10%的SDS、0.5ml 2-巰基乙醇、1ml 1%溴酚藍(lán)，0.9ml的蒸餾水，可在4℃保存數(shù)周，或在-20℃保存數(shù)月。
③ 二抗稀釋液
AP-Anti mouse IgG(Whole molecule),SIGMA,CAT#A-3562;
AP-Anti mouse IgGAM,ZYMED,CAT#62-6422
一般采取1:3000-1:5000的稀釋度，用1%BSA-PBS（含0.05%TWEEN20）稀釋
④ 顯色底物緩沖液
A.HRP標(biāo)記二抗底物緩沖液
DAB KIT（KPL LOT NO YM107 CAT：54-10-00）, Tris Buffer 3滴，DAB Substrate 3滴,Peroxide solution 2滴于5ml蒸餾水中，避光，混勻
B.AKP標(biāo)記二抗底物緩沖液
AKP緩沖液：
0.1mol/L Tris-HCL（PH9.5）, 0.1mol/L NaCL, 5mmol/L MgCL2
BCIP溶液/NBT溶液：
50mg/ml BCIP溶于100%二甲基甲酰胺
50mg/ml BCIP溶于70%二甲基甲酰胺
⑤ 其他試劑
A．        考馬斯亮藍(lán)染液，1L
考馬斯亮藍(lán)R-250 1.0g、甲醇 450ml、冰醋酸 100ml
B．        考馬斯亮藍(lán)脫色液
甲醇 100ml、冰醋酸 100ml、蒸餾水800ml

二、方法
1．Bio-Rad微型凝膠電泳模具的安裝
帶上手套將凝膠電泳系統(tǒng)的前后玻璃板，梳子用去污劑洗滌，后再用去離子水沖洗干凈，除去黏附在玻璃板上凝固的膠和其他污垢。晾干玻璃板或用電吹風(fēng)吹干。將玻璃板的橡膠墊條用吸水紙吸干，然后按Bio-Rad Mini-Protean電泳系統(tǒng)的使用說(shuō)明書安裝好玻璃板，固定于制膠板上。

2．SDS-PAGE凝膠的配制
① 根據(jù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗原的分子量大小選擇合適的電泳分離膠濃度。確定分離膠所需凝膠溶液體積（這些數(shù)據(jù)一般由廠家提供，例如Bio-Rad Mini-Protean 3 Elecreophoresis Cel 83mm×75mm×0.75mm,兩塊膠需8ml）
按下表給出數(shù)據(jù)在一小燒杯中按所需丙烯酰胺濃度配置一定體積的分離膠溶液。依次混合各成分。

10ml分離膠各成分所需體積（ml）
        濃度
溶液成分        8%        12%        15%
水        4.6        3.3        2.3
30%丙烯酰胺        2.7        4.0        5.0
1.5mol/L Tris(pH8.8)        2.5        2.5        2.5
10%SDS        0.1        0.1        0.1
10%過(guò)硫酸銨        0.1        0.1        0.1
TEMED        0.006        0.004        0.004
一旦加入TEMED，馬上開始聚合，故應(yīng)立即快速旋動(dòng)混合物并進(jìn)入下步操作。
② 迅速在兩玻璃板的間隙中灌注丙烯酰胺溶液，不能有氣泡，留出灌注積層膠所需空間（梳子的齒長(zhǎng)再加1cm）。然后小心的在分離膠溶液上覆蓋一層1-5mm的水層，這使凝膠表面變的平整。
③ 等待30-60min，使凝膠聚合。當(dāng)凝膠聚合后，在分離膠和水層之間會(huì)出現(xiàn)一個(gè)清晰的界面，可以微微傾斜模具，檢測(cè)凝膠是否聚合。用去離子水洗滌凝膠頂部數(shù)次以除去未聚合的凝膠，盡可能排去凝膠上的液體，再用濾紙吸凈殘留液體，注意不要接觸膠面。
④ 按下法制備積層膠：按下表給出數(shù)據(jù)在一個(gè)干凈的試管或小燒杯中制備一定體積濃度為5%的丙烯酰胺溶液，依次混合各成分。（兩塊5%積層膠Bio-Rad Mini-Protean 83mm×75mm×0.75mm, 兩塊膠需3ml）

不同體積積層膠各成分所需體積（ml）
       體積
溶液成分        2        3        5
水        1.4        2.1        3.4
30%丙烯酰胺        0.33        0.5        0.83
1mol/L Tris(pH6.8)        0.25        0.38        0.63
10%SDS        0.02        0.01        0.05
10%過(guò)硫酸銨        0.02        0.03        0.05
TEMED        0.002        0.003        0.005
一旦加入TEMED，馬上開始聚合，故應(yīng)立即快速旋動(dòng)混合物并進(jìn)入下一步操作。
⑤ 在已聚合的分離膠上直接灌注積層液。立即在積層膠溶液中插入干凈的實(shí)驗(yàn)預(yù)設(shè)計(jì)的梳子，小心避免混入氣泡，將凝膠垂直放置于室溫下。
⑥ 積層膠聚合*后（30min）,小心移出梳子，使用洗瓶立即用去離子水洗滌加樣槽以除去未聚合的丙烯酰胺。把凝膠固定于電泳裝置上，上下槽各加入Tris甘氨酸電泳緩沖液。

3．SDS-PAGE電泳
① 將抗原（細(xì)胞裂解液、重組蛋白）樣品置于凝膠加樣緩沖液中，在100℃加熱三分鐘以使蛋白質(zhì)變性。
② 設(shè)計(jì)加樣順序，作好實(shí)驗(yàn)記錄，按預(yù)定順序加樣。一般每個(gè)電泳道加樣大體積為25µl,每個(gè)電泳道上樣的低蛋白質(zhì)量（每一條蛋白質(zhì)條帶）：0.1µg（考馬斯亮藍(lán)染色）-2ng（銀染色）,高蛋白質(zhì)量（蛋白質(zhì)混合物）：20-40µg。
③ 把電泳裝置與電源連接好，將電壓調(diào)至200V，電流應(yīng)流向陽(yáng)極，待溴酚藍(lán)遷移到分離膠底部0.5cm處，關(guān)閉電源。
④ 從電泳裝置上卸下凝膠玻璃板，用去離子水沖洗干凈。準(zhǔn)備進(jìn)行免疫印操作。

4．免疫印跡操作-轉(zhuǎn)膜
① 將凝膠玻璃板置于盛有電泳轉(zhuǎn)移緩沖液的容器中，浸泡15-20min.
② 帶上手套，裁剪好濾紙（Whatman,3MM CHR）和NC膜，濾紙和膜大小為83mm×75mm，盡量避免污染濾紙和膜，將裁減好的濾紙和膜浸泡與電泳轉(zhuǎn)移緩沖液中，驅(qū)除留于膜上的氣泡。
③ 打開轉(zhuǎn)移盒并放置淺盤中，用轉(zhuǎn)移緩沖液將海綿墊*浸透后將其放在轉(zhuǎn)移盒壁上，海綿上再放置一張浸濕的Whatman,3MM濾紙。
④ 小心將凝膠放置于濾紙上，避免氣泡（用轉(zhuǎn)移緩沖液潤(rùn)濕并戴手套以轉(zhuǎn)移緩沖液潤(rùn)濕膠面，小心將NC膜放在膠面上，從凝膠的一邊開始輕輕放下可避免氣泡，注意一定要戴手套或鑷子接觸膜）。
⑤用去離子水清洗緩沖液槽，在緩沖液槽中放入攪拌子，將另一塊海綿用轉(zhuǎn)移緩沖液浸透后放在凝膠-膜“三明治”上，關(guān)上轉(zhuǎn)移盒并插入轉(zhuǎn)移槽。
⑥將冰盒裝入緩沖液槽，注滿4℃預(yù)冷的轉(zhuǎn)移緩沖液。
⑦將整個(gè)裝置放在磁力攪拌器上并開始攪拌，連接好轉(zhuǎn)移電極恒壓100V轉(zhuǎn)移90min，若轉(zhuǎn)移過(guò)夜則恒壓30V。
⑧電轉(zhuǎn)完畢后，將NC膜置于5%的脫脂奶粉（PBS配制）中封閉，37℃2小時(shí)或4℃過(guò)夜。

5．免疫檢測(cè)
一抗與靶蛋白的結(jié)合
① 封閉的膜用PBST漂洗2-3次。
② 將加樣槽洗滌干凈，用蒸餾水潤(rùn)洗，晾干，將膜用一次性手套覆蓋好，按標(biāo)記和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)切下膜條（一般為3 mm寬左右）按順序置于加樣槽中，作好實(shí)驗(yàn)記錄，加入相應(yīng)的一抗約1ml，注意保證膜的所有部分同溶液接觸。
③ 室溫下于搖床孵育2h或4℃過(guò)夜。
④ 棄去一抗，膜條仍置于加樣槽，每個(gè)槽加2-3 mlPBST，上搖床洗滌洗滌5-10min ，換液，反復(fù)4次。
  酶標(biāo)記二抗與一抗的結(jié)合
① 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要和設(shè)計(jì)選擇合適的酶標(biāo)二抗和稀釋濃度（用含0.5%脫脂奶粉的PBS稀釋），每個(gè)加樣槽中加入二抗1ml左右室溫下于搖床孵育1h或4℃過(guò)夜，注意保證膜的所有部分同溶液接觸。
②棄去二抗，膜條仍置于加樣槽，每個(gè)槽加2-3 mlPBST，上搖床洗滌洗滌5-10min ，換液，反復(fù)4次。

顯色反應(yīng)（注：二抗一般有兩種常用標(biāo)記酶，HRP和AP，其相對(duì)應(yīng)的顯色底物試劑盒為DAB和BCIP/NBT）
① HRP標(biāo)記二抗顯色
   用DAB KIT（KPL LOT NO YM107 CAT：54-10-00）顯色，按順序依次加Tris Buffer 3滴，DAB Substrate 3滴,Peroxide solution 2滴于5ml蒸餾水中，避光，混勻，將膜加入顯色液中避光顯色15 min左右終止反應(yīng)，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將NC膜晾干掃描保存
②        AKP標(biāo)記二抗顯色
   用AKP緩沖液洗膜5min，棄去AP緩沖液，加入顯色液（66µlNBT溶液同10mlAKP緩沖液充分混合均勻后加入33µl BCIP溶液1h內(nèi)使用），室溫下顯色（37℃可加速反應(yīng)），顯色反應(yīng)通常在30min內(nèi)可完成。用20mM EDTA/TBS洗膜終止反應(yīng),記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將NC膜晾干掃描保存。反應(yīng)溶液可預(yù)先配置，可在4℃儲(chǔ)存一年以上。

三、說(shuō)明
1．        WB對(duì)照系統(tǒng)
陽(yáng)性對(duì)照：有標(biāo)準(zhǔn)品，或陽(yáng)性血清、陽(yáng)性上清。
陰性對(duì)照：測(cè)血時(shí)用相應(yīng)小鼠未免疫血清，測(cè)培養(yǎng)上清，用無(wú)克隆培養(yǎng)上清。
空白對(duì)照：不加一抗，用1%BSA代替。
無(wú)關(guān)對(duì)照（替代對(duì)照）：用無(wú)關(guān)項(xiàng)目一抗，或無(wú)關(guān)項(xiàng)目的抗體。
2.切割膜時(shí)，大小一般為3-5mm,一抗的體積為每條膜保證1ml。
3.KSHV、MCMV、HCMV項(xiàng)目測(cè)血時(shí)，血清稀釋度為1:500-1:1000。
4. KSHV、MCMV、HCMV項(xiàng)目WB鑒定時(shí)，一抗如為IgG型,二抗采用AP-Anti mouse IgG(Whole molecule),SIGMA,CAT#A-3562; 一抗如為IgM型，二抗采用AP-Anti mouse IgGAM,ZYMED,CAT#62-6422。
5.多肽項(xiàng)目WB鑒定，二抗全部采用AP-Anti mouse IgG(Whole molecule),SIGMA,CAT#A-3562。