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人胚胎干細(xì)胞系:衍生與培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)步驟    
2.3 小 鼠 胚 胎 飼 養(yǎng) 細(xì) 胞（MEF) 的 制 備

廣泛地用于支持 h E S 的伺養(yǎng)層細(xì)胞來自小鼠胚胎 [丁]^〇 1113 〇 1161&1,， 1998;Reu-binoffetal. ， 2000]，如小鼠胚胎飼養(yǎng)細(xì)胞（MEFs) ，盡管它們可能是原始的間葉細(xì)胞的前體細(xì)胞。

每一 種 h E S 細(xì)胞系在不同的詞養(yǎng)層細(xì)胞上的生長(zhǎng)可能不同，這點(diǎn)要注意，對(duì)于率的增殖有些飼養(yǎng)層細(xì)胞比另外一些細(xì)胞更合適，通常要傳 5?10代以確保細(xì)胞適應(yīng)于新的伺養(yǎng)細(xì)胞。始終要做到只要細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)條件改變，就要對(duì)細(xì)胞的核型穩(wěn)定性和多能性進(jìn)行嚴(yán)格的核查。方 案 2. 1 介紹了原代 M E F 細(xì)胞的分離培養(yǎng)。

2.3.1 原代培養(yǎng)

小鼠胚胎飼養(yǎng)細(xì)胞能夠從妊娠〗15.5 —— 16.5 天 的 小 鼠 胚 胎（E15.5?E 16.5 ) 中分離出來，培養(yǎng)過程易于生長(zhǎng)，是一種可靠的、持 續(xù) 的 飼 養(yǎng) 細(xì) 胞 的 來 源 ，并能在液氮中維持很長(zhǎng)時(shí)間。 MEFs 通常是在復(fù)蘇之后 2?5 天使用。方 案 2 . 1 是 由 N agy 等人的方 案 修 改 而 來 [2003]

方 案 2.1 小 鼠 胚 胎 飼 養(yǎng) 細(xì) 胞（M E F s) 的 原 代 培 養(yǎng)

試劑與材料

無菌或無菌制備

□ MEFM (見 2. 2. 3)

□ 無 Ca2+ 和 Mg2+ 磷 酸 鹽 緩 沖 液（PBSA)

□ 胰 蛋 白 酶 ， 0 . 2 5 % , 用 GIBCO 溶 液 A 配 制（參 見 2. 9 節(jié)）

□ 乙 醇 7 0 %

□ 75 cm2 培養(yǎng)瓶

□ l0 cm Petri 培養(yǎng)皿，塑料的，非組織培養(yǎng)級(jí)別

□帶螺蓋的離心管 ， 15m l 和 50 ml

□用于解剖的鑷子和解剖刀（使用之前高壓消毒并保存在 70% 酒 精 中 )

□可更換的解剖刀片， 1 1 號(hào)

非無菌

□計(jì)時(shí)妊娠鼠， 15.5?16.5 天（經(jīng)典常用的小鼠品系包括 SV 129 和C 57： BL)

步驟

(a) 處 死 妊 娠 15. 5?16. 5 天的小鼠。

(b) 用 70 % 酒精擦洗鼠的腹面。

(c) 剪開皮膚和組織暴露子宮。

(d) 取出子宮角并放到含有 P B S A 的 10 cm Petri 塑料皿里。

(e) 用解剖刀從胚囊中取出胚胎，丟棄其他所有的組織包括胎盤以及胎膜。

(f) 取出含有腦組織的頭的上部并丟棄。

(g) 沿著從頭到尾的中軸從幼崽前端開始切開胚胎進(jìn)行解剖，暴露及丟棄內(nèi)部器官。

(h) 把胚胎剩余部分放在 50m l 離心管里用 P B SA 洗 4 遍 。

(i) 把胚胎剩余部分轉(zhuǎn)人干凈的 10 cm Petri 皿 中 ，去 掉 PBSA ，把胚胎用新的解剖刀切 成 2 mm 大小的小塊。

(j) 把切碎的胚胎放到 15m l 離心管里，加 人 IOml 0 . 2 5 % 的胰蛋白酶，在 37°C 孵育 10?20 min。

(K) 使小塊沉淀下來，從孵育管中取出 5m l 胰蛋白酶以及分散的細(xì)胞，并且放到無 菌 的 50m l 的離心管里。

(l) 加人等體積的 M EFM 抑制胰蛋白酶活性。

(m) 再 加 人 5 ml 0. 2 5 % 胰蛋白酶到原先的含有胚胎的 15m l 離心管里，并 在 37°C再 孵 育 10’?20 min

(n) 重 復(fù) 步 驟（k) ，（I), (m ) ，大 約 進(jìn) 行 5 次孵育，將所有加人的胰蛋白酶以及分散的細(xì)胞放人同一個(gè) 50m l 離心管。只有沒溶解的軟骨將被留在原先的含有胚胎的15m l 管中。

(O) 用力地分散胰蛋白酶消化的細(xì)胞懸液并允許剩余的小塊沉淀。

(P) 取出并保存上清液，去除沉淀。

(q) 離心上清液， l000 g ， 5 min

(r) 用 IOml MEFM 重懸沉淀并用臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)

(s) 每 個(gè) 160 cm2 培養(yǎng)瓶接種 5 X IO6 細(xì)胞，再 加 人 IOml MEFM。

(t) 在 37°C 、5 % C02 溫箱里孵育過夜。

(u) 第二天，用 20m l 的新鮮的 M EFM 培養(yǎng)基置換舊的培養(yǎng)基以去除細(xì)胞的碎片。

(V) 在凍存之前使細(xì)胞長(zhǎng)到 8 0 % ?9 0 % 匯合。

注意： 要 確 保 MEFs 細(xì)胞*沒有被任何微生物所污染，每次從小鼠胚胎新制備MEFs, 要在無抗生素的培養(yǎng)基中至少連續(xù)傳]5 代 ，在這個(gè)時(shí)期如果沒有觀察到微生物污染，那么早期傳代的細(xì)胞就可以擴(kuò)增，并大量分裝凍存起來，隨后能夠安全地用于日常 H ES 細(xì)胞的增殖。

2.3.2 M E F s 的繼代培養(yǎng)

為了維持細(xì)胞庫(kù)的供應(yīng)以及避免出現(xiàn)先前討論過的細(xì)胞衰老，關(guān)注 M E F s 的傳代次數(shù)是關(guān)鍵，簡(jiǎn)而言之，應(yīng)該以較低傳代次數(shù)（p 〇?p2 ) 的細(xì)胞用于維持細(xì)胞庫(kù)，以較高傳代次數(shù)（P3 和 p4 ) 的細(xì)胞用于制備無活性的可支持 h E S 細(xì)胞的詢養(yǎng)層。 M EFs細(xì)胞在 4 代以后不能使用，這很重要，因?yàn)檫@個(gè)時(shí)期細(xì)胞已經(jīng)衰老并可能很難擴(kuò)增了。

M E R s 將在 75 cm2 或 225 cm2 的組織培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)，這主要取決于需要多少飼養(yǎng)細(xì)胞（M E F s)s 在制備飼養(yǎng)層細(xì)胞板時(shí)，一個(gè) 75 cm2 培養(yǎng)瓶的 M E F s 如果滅活時(shí)達(dá)到80% 匯合，就可以為 2?6 個(gè) 4 孔培養(yǎng)板提供細(xì)胞.s.—個(gè) 225 cm2 培養(yǎng)瓶的 M E F s 可用于大量?jī)?chǔ)存細(xì)胞或者用來制備大量無活性的飼養(yǎng)層細(xì)胞板 a, 在進(jìn)行 h E S 細(xì)胞培養(yǎng)工作
之前. ，有必要準(zhǔn)備好充足的細(xì)胞儲(chǔ)備供應(yīng)，要確保飼養(yǎng)細(xì)胞不短缺。用 225 cm2 培養(yǎng)瓶的大量傳代將提供更快的 M E F s 細(xì)胞儲(chǔ)備，因此方案 2. 2 討論了一個(gè) 225 cm2 培養(yǎng)瓶的M E F s 細(xì)胞傳代的容量問題。為了工作容量進(jìn)行傳代，可 將 一 個(gè) 的 培 養(yǎng) 瓶 平均分為 3 份，而每個(gè) 225 cm2 培養(yǎng)瓶的 M E F s 細(xì)胞應(yīng)該按 1 :3 的比例再產(chǎn)生三個(gè) 225 cm2 培養(yǎng)瓶的 M E F s 用于儲(chǔ)備。

方 案 2.2 小 鼠 胚 胎 飼 養(yǎng) 細(xì) 胞（M E F s) 的 傳代

試劑與材料

無菌或無菌制備

□0?3 代的 M E F s 大約 80% 匯合， 75 Cm2 或 225 cm2 培養(yǎng)瓶

□ MEFM (見 2. 2. 3)

□明 膠（高溫高壓滅菌， 0. 1% W /V

□ 胰 蛋 白 酶 ， 0 . 2 5 % ，溶 于 GffiCO 溶 液 A ( 見 2. 9 節(jié))

□ PBSA

□臺(tái)盼藍(lán)活性染色

□ 離 心 管 ， 15 ml

□ 組 織 培 養(yǎng) 瓶 ， 3 X 225 Cm2

□血細(xì)胞計(jì)數(shù)板

步驟

(a) 從 225 cm2 培養(yǎng)瓶中吸出培養(yǎng)基并用 IOml 的 P B SA 洗一次細(xì)胞。

(b) 力口 3m l 的胰蛋白酶并在 37°C 孵育細(xì)胞 4 min。

(c) 從孵箱里取出培養(yǎng)瓶并輕輕地敲擊使 M E F s 進(jìn)一步脫離培養(yǎng)瓶。

(d) 加 入 6m l 的 M EFM ，打散所有細(xì)胞確保沒有粘連并防止成團(tuán)。

(e) 將培養(yǎng)基和懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)人 15m l 離心管中。

(h) 離 心 5m in， lOOOg。

(g) 把 5 ml 0. 1 % 明膠加人 3 個(gè)新的無菌的并將有 M E F s 傳 人 的 225 cm2 的培養(yǎng)瓶中 ，室溫下與凝膠少孵育 5 min 。

(h) 從離心管中取出 M E F s 并吸出培養(yǎng)基，敲擊管壁分散細(xì)胞沉淀，用 3m l 新鮮的 M EFM 重懸。用吸管吹散細(xì)胞以確保細(xì)胞是單細(xì)胞懸液，這對(duì)于傳代培養(yǎng)瓶中細(xì)胞的均一生長(zhǎng)是必要的。

(i) 從每個(gè)新的培養(yǎng)瓶中吸出 5 ml 0 . 1 % 明膠，加 入 25 ml M EFM 培養(yǎng)基。

(j) 把 3m l 的 M E Fs 分配 到 3 個(gè) 225 cm2 培養(yǎng)瓶中。

(k) 每 個(gè) 225 cm2 培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞在下次傳代時(shí)將繼續(xù)分 3 份 。

來自前三代的 M E F s 細(xì) 胞（P0?P3 ) 的每一代都能凍存起來維持細(xì)胞的儲(chǔ)備或者被傳代 為 h E S 細(xì)胞的增殖提供飼養(yǎng)細(xì)胞（見 2. 3. 5 節(jié)）。

4 代之后， M E F s 應(yīng)該被丟棄因?yàn)檫@些細(xì)胞可能衰老或發(fā)生改變。

2.3.3 凍存小鼠胚胎飼養(yǎng)細(xì)胞

如 果 M EF 細(xì)胞要用于 hES 細(xì)胞的培養(yǎng)過程，那就必須維持大量的、高質(zhì)量的、不同代（PO?P4) 的 MEFS 冷凍貯存。傳代次數(shù)早的細(xì)胞（p0?p2 ) 應(yīng)該作為細(xì)胞儲(chǔ)備的種子細(xì)胞，它們可以繼續(xù)傳代，再次凍存以提供大量的更高代次的細(xì)胞（p3?p4 ) 來 維 持 hES細(xì)胞的日常生長(zhǎng)。一 個(gè) 7Scm2 培養(yǎng)瓶有 8 0 % 匯 合的 M EF 細(xì)胞將凍存產(chǎn)生一個(gè)凍存管的儲(chǔ)
備細(xì)胞，一 個(gè) 225 cm2 培養(yǎng)瓶的細(xì)胞將凍存產(chǎn)生 3 個(gè)凍存管的儲(chǔ)備細(xì)胞。

方 案 2.3 小 鼠 胚 胎 飼 養(yǎng) 細(xì) 胞 的 凍 存

試劑與材料

無菌或無菌制備

□ 含 有 M EFs 細(xì)胞的 75 cm2 培養(yǎng)瓶或 225 cm2 培養(yǎng)瓶， p0?p4， 8 〇% ? 90% 細(xì)胞匯合

□ M E F M (見 2. 2. 3 節(jié)）

□ 胰 蛋 白 酶 ， 0 . 2 5 % ， ED TA，溶 于 GIBCO 溶 液 A (見 2. 9 節(jié))

□ E S F B S

□ D M SO

□ P B S A

□ 離 心管， 15 ml

□凍存管

步驟

(a) 從 含 有 MEFs 細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中去除培養(yǎng)基，并 用 P B S A 洗 一 遍 ，每 個(gè) 75 cm2培養(yǎng)瓶用 5 ml。

(b) 每 個(gè) 75 cm2 培養(yǎng)瓶中加入胰蛋白酶 lm l，確保整個(gè)培養(yǎng)瓶的單層細(xì)胞都能被覆蓋 ， 37℃孵育 4min。

(c) 輕輕地敲打培養(yǎng)瓶使細(xì)胞進(jìn)一步脫落。加 入 5 ml M EFM 終止胰蛋白酶反應(yīng)，吹 散 5?6 次確保所有細(xì)胞沒有粘連并防止成團(tuán)。把 含 有 M E F s 的 培 養(yǎng) 基 轉(zhuǎn) 人 15m l 離心管。

(d) 離心 5 min， IOOOg

(e) 為凍存準(zhǔn)備凍存管及寫標(biāo)簽。標(biāo) 簽 內(nèi) 容 應(yīng) 該 包 括 M E F s 細(xì)胞新傳代的代次,曰期和任何可能需要的信息。在無菌條件下將 lOOy DMSO 加人備好的凍存管里。

(f) 吸去上清，小心不要攪亂細(xì)胞沉淀。

(g ) 用 E S F B S 重懸細(xì)胞沉淀，每 個(gè) 75 cm2 培 養(yǎng) 瓶 900uI，用塑料吸管打散細(xì)胞，確認(rèn)細(xì)胞沉淀已混勻。

(h) 把 含 有 M E F s 細(xì) 胞 的 E S F B S 轉(zhuǎn) 移 到 裝 有 DM SO 的凍存 管 里 ，立即儲(chǔ)存到-80°C 冰箱過夜，儲(chǔ)存之前要 *混勻。

(i) 第二天，把凍存管放到液氮里長(zhǎng)期保存。

2.3.4 M E F s 細(xì)胞的復(fù)蘇

從長(zhǎng)期液氮保存中復(fù)蘇 M E F 細(xì)胞，用于補(bǔ)充 M E F s 的儲(chǔ)備或者用于滅活處理后支持未分化 hES 的 生 長(zhǎng) 。

方 案 2. 4 復(fù) 蘇 凍 存 的 小 鼠 胚 胎 飼 養(yǎng) 細(xì) 胞

試劑與材料

無菌或無菌制備

□ 一 支 M E F s 凍存管

□ MEFM (見 2. 2. 3 節(jié)）

□ 明 膠 ， 0. 1 % (高溫髙壓滅菌)

□組織培養(yǎng)瓶， 75 cm2

□ 水 浴 箱 ，設(shè)置 在 37°C

□ 吸 管 ， Iml

步驟

(a) 在 75 cm2 培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加 3 ml 0 . 1 % 明膠，覆蓋細(xì)胞將要黏附的表面，室溫孵育至少 5 min

(b) 從液氮罐中取出一支 M E Fs 凍存管。

(c) 在 37°C 水浴箱中快速解凍細(xì)胞。

(d) 把 0. 1 % 明膠從 7 5 cm2 培養(yǎng)瓶中吸出并加入 7m l 的 M EFM 培養(yǎng)基。

(e) 用 Im l 吸管把含有 M E Fs 細(xì)胞的 E S F B S / D M S O 混合液從凍存管里轉(zhuǎn)移到含有M EFM 培養(yǎng)基的 75 cm2 培養(yǎng)瓶中。

(f) 在 37°C 孵育細(xì)胞過夜。

(g) 第二天早上用新鮮的 M EFM 培養(yǎng)基替換 7m l 培養(yǎng)基去除殘留的 DM SO 和細(xì)胞碎片。

(h) M E F s 細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá) 5 天或細(xì)胞匯合達(dá)到 8 0 % ，每 2 天換一次液。

2.3.5 基于化學(xué)方法的 M E R s 細(xì)胞失活

MEFs (P0?P4 ) 是一種快速分裂的細(xì)胞，因而在作為飼養(yǎng)細(xì)胞層使用之前需要抑制有分裂避免其過度生長(zhǎng)。細(xì)胞分裂的抑制可通過放射和化學(xué)阻斷方法獲得，普遍的是使用 C ，它是一種為日常培養(yǎng) h E S 細(xì) 胞 而 準(zhǔn) 備 M E F s 細(xì)胞的簡(jiǎn)單、有效的方法。

安全提示：對(duì) C 進(jìn)行操作時(shí)一定要當(dāng)心，因?yàn)樗星矀鞫拘浴Ｊ冀K要戴手套，并且只能在 I I 類 通 風(fēng) 櫥（小的生物安全柜）內(nèi)操作。

h E S 細(xì)胞的增殖需要使 M E F 細(xì)胞失活，一 個(gè) 75 cm2 培養(yǎng)瓶大約 8 0 % 匯 合 的 MEFs細(xì)胞通常能提供 2 ?4 個(gè)（取 決 于 M E F s 細(xì)胞的產(chǎn)量）4 孔板 。方 案 2. 5 討論了一75 cm2 培養(yǎng)瓶或一個(gè) 225 cm2 培 養(yǎng) 瓶 的 M E F s 細(xì)胞的失活處理，使 用 225 cm2 培養(yǎng)瓶需
要 3 倍試劑和培養(yǎng)基。

方 案 2. 5 小 鼠 胚 胎 飼 養(yǎng) 細(xì) 胞 的 生 長(zhǎng) 抑 制

試劑與材料

無菌或無菌制備

□ 8 0 % ?9 0 % 匯 合 的 M EFs 細(xì)胞， 75 cm2 培 養(yǎng) 瓶（或 225 cm2)

□ MEFM (見 2. 2. 3 節(jié)）

□ 胰 蛋 白 酶 ， 0 . 2 5 % ， 溶 解 于 GIBCO 溶 液 A (參見 2. 9 節(jié)）

□ PBSA

□ 明 膠 ， 0. 1 %

□  C (MMC), 50 ug /ml, 溶解 于 DMEM (過濾除菌）

□多孔培養(yǎng)板， 4 孔 ：通 常 每 75 cm2 培養(yǎng)瓶的 M E F s 細(xì)胞需 要 1 ?4 個(gè)培養(yǎng)板

□吸管

□ 離 心 管 ， 15 ml

步驟

(a) 用 MEFM 以 1 : 10稀釋 MMC，從 50 Mg/ml 稀釋至 5 ug/ml。

(b) 在 4 孔培養(yǎng)板的每個(gè)孔中加人0.5m l 的明膠。

(c) 從 孵 育 箱 里 取 出 75 cm2 培 養(yǎng) 瓶 ，內(nèi) 有 8 0 % 匯 合 生 長(zhǎng) 的 p3 或 p4 代 的 MEFs細(xì)胞。

(d) 用 IOmI 的 5ug/ml：MMC，在 37°C 孵育 MEFs 細(xì)胞 2 h。

注意：因?yàn)橹苽涞?M E F 細(xì)胞可能有變化，新的使用者將要確定 M M C *抑制細(xì)抱分裂的濃度和孵育時(shí)間。

(e) 在 M M C 孵育的期間，把 0 . 1 % 明膠涂到 4 孔板，至少在使用前 5 min 涂板。

(f) 用 M M C 處理完之后，用 5m l 的 P B SA 洗細(xì)胞一次。

(g) 加 Im l 胰蛋白酶，于 37℃孵育 4 min。

(h) 輕輕地敲擊培養(yǎng)瓶使所有的細(xì)胞脫落，并加人等體積的 M EFM 終止胰蛋白酶反應(yīng)，轉(zhuǎn) 移 到 15m l 的離心管。

(i) 在 含 有 M E F s 細(xì) 胞 的 15m l 離 心 管 里 加 人 M E FM 培 養(yǎng) 基 使 總 體 積 達(dá) 到 6 ml，IOOOg 離心 5 min。

(j ) 吸去上清，用 5m l 的 M EFM 重懸 M E F 細(xì)胞沉淀，仔細(xì)確認(rèn)是單細(xì)胞懸液。

(k) 用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞。

(l) 從 4 孔板吸掉明膠。

(m) 每 個(gè) 孔 以 7. 5 X 104 個(gè) 接 種 M E F s 細(xì)胞 ，并 且 每 個(gè) 孔 中 M E F M 的總量達(dá)到500ul。 M E F s 細(xì)胞將在 6 h 內(nèi)貼壁。

(H) 把新接種的培養(yǎng)板放到孵育箱里，準(zhǔn)備第二天使用。

注意： M E F 細(xì)胞在失活之后死亡之前，能夠 作 為 h E S 細(xì)胞的飼養(yǎng)細(xì)胞來使用的時(shí)間 為 7 天，理想的情況是把 h E S 細(xì)胞傳到 M E F s 細(xì)胞失活 1?3 天內(nèi)的培養(yǎng)板上。