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基礎篇
一、如何選擇試劑，評價試劑是否符合自己實驗室條件？
現在臨床PCR實驗室使用的試劑大部分都是各生產企業提供的商品化的試劑盒，那么試劑質量的好壞直接決定了實驗結果的好壞，而不同廠家試劑的性能、質量和價格千差萬別，如何選擇一款合適的試劑對每個PCR實驗室都至關重要，一般來說，選擇試劑主要從以下幾個方面進行評價：
1、重復性
首先，試劑檢測結果的重復性直接展現了試劑的方法學及其質量的好壞，是評價試劑好壞明顯、直接的指標。
其次，我們在此說的試劑重復性是指對原始樣本檢測的重復性，而不是對某一個樣本提取的核酸進行重復性的檢測和評價。
后，試劑的重復性對于療效檢測、用藥指導有著重大的意義，一個重復性好的試劑，往往能夠在病人的抗病毒治療過程中，給醫生和病人提供直接、可靠的數據，讓醫生和病人對疾病進展有更清楚的認識，從而制定合理的治療方案，實現更好的治療效果。
2、靈敏度
一個試劑的靈敏度往往能夠體現該試劑的技術水平和先進程度，同時對于臨床病癥的監測有著*的意義。以乙肝為例來說，我國的乙肝復發率遠遠大于發達國家，同時由乙肝病毒感染轉換為慢性肝炎、肝硬化、肝癌的患者也居世界前列，這很大程度上與對低載量病毒監控的嚴重不足有關。美國肝病學會專家組就提出，對乙肝抗病毒治療過程中，HBV DNA的低監測點應設置為10IU/ml，而歐洲和亞太肝病學也指出HBV DNA病毒載量應該盡可能小于10IU/ml。這都足以證明，高靈敏度對于用藥治療、病程監控等起著巨大的作用，靈敏度越高，對于疾病的監控效果更好，對于確定治療的終點，具有積極的指導作用。
3、定量準確性
對于臨床檢測中定量項目來說，試劑盒定量的準確性是非常重要的，也是評價定量試劑盒的一個重要指標之一。衛生部每年都會有2次全國性的室間質評，通過質評結果可以很好的看出試劑盒定量的準確性。
但往往很多時候，實驗室在選擇試劑的時候都偏重與過去的試劑盒比較定量結果的差異，并以過去的試劑盒定值作為標準來參考和評價一種新試劑，其實這種方法不*可取。不過可以通過同時檢測衛生部的質控品來進行比較，這樣才使得兩種試劑在同一客觀標準上進行PK，得到合理公平的評價。
同時，要驗證一個試劑的定量是否準確，我們可以采用一個高濃度樣本，用陰性血清依次進行10倍梯度的稀釋，然后選取多家試劑公司的產品進行同步檢測PK，考察各公司試劑對樣本定值的實際值與理論值的差異，即可判斷各公司試劑定量準確與否。
 
4、有無內標監測
內標的一個主要的作用就是控制假陰性結果的發生，但在國內臨床檢測中往往被忽視了，這主要與兩個方面有關，一個是之前國內使用的很多熒光定量PCR儀均為單通道的儀器，無法進行多色熒光的檢測；國內外PCR行業對內標的研究已不是一個新興課題，目前國內PCR行業能把內標做得非常好的科研單位或商業化的PCR試劑廠家，這正體現了這一技術的難度。
在臨床檢測中，內標的作用非常重要。在臨床檢測過程中，怎么做到每一個陰性結果均為真正的陰性結果，從而杜絕因擴增抑制而出現的假陰性結果呢？內標的加入就能夠很好的防止假陰性結果了，加入我們做了一個樣本，它的目標檢測熒光為陰性，內標檢測熒光也為陰性，那么這個樣本的擴增則受到了抑制，該陰性結果為假陰性，我們必須對該樣本進行復檢。如果試劑沒有內標的話，我們則不能很好的判斷該結果是否正常？是否可以發報告？在發報告時，我們無法保證發出去的結果的準確；內標的加入，就可以解決我們這方面的煩惱。目前，衛生部的專家也在大力推崇內標的重要性，也是為了保證檢驗結果的準確可靠。
5、線性定量范圍
試劑盒的線性定量范圍指的是試劑盒低檢測下限和高檢測上限之間的范圍，范圍越寬說明試劑盒性能越好。
6、UNG酶防污染體系
PCR反應過程中， 1個拷貝的DNA經過30個循環后，可以增長到10億個拷貝的產物DNA， 極微量的PCR 產物污染，就可能造成假陽性，因而這是一個值得特別重視的問題。
尿嘧啶糖苷酶（UNG）法：將PCR 產物中的dT用dU 代替。這種dU 化的PCR 產物與UNG 一起孵育，因UNG 可裂解尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架間的N-糖基鍵，可除去dU 而阻止TaqDNA 聚合酶的延伸，從而失去被再擴增的能力。UNG 對不含dU 的模板無任何影響，UNG 可從單或雙鏈DNA 中消除尿嘧啶，而對RNA 中的尿嘧啶和單一尿嘧啶分子則無任何作用。
此外，試劑的穩定性、批間差、溯源性（是否溯源于WHO標準品）等也都是考察一款試劑盒質量重要指標。
 
二、如何選擇熒光定量PCR儀器？
1、儀器使用的廣泛程度
如果不是一個新出現的儀器品牌，為保證所購置的儀器有充分的可靠性，臨床PCR實驗室可以從相應儀器在國內外使用的廣泛程度來判斷。應用越是廣泛的儀器，越是經過實踐驗證的，也就越具有可靠性。
2、儀器的檢測通量（反應孔數）
在購買定量PCR儀的時候需要根據實驗室的要求來選擇不同通量的儀器。目前市面上的熒光定量PCR儀的檢測通量小到16多到384孔，實驗室可以根據自己的檢測項目和發展狀況，選擇合適的儀器，沒必要追求昂貴的儀器，一般來說，96孔的通量足夠用了；如需尋找新藥靶點和疾病標記等類型的實驗，則可以考慮購買384孔的儀器。
3、儀器的通道數量
隨著醫院開展的項目越來越多，比如基因表達，單核苷酸多態性分析、高分辨率熔解曲線等，那么單通道的儀器則無法滿足實驗室的需求了，而多通道的設計則能使其更方便地檢測多重PCR檢測及其衍生的基因表達等其他分析模式。
4、耗材的開放性
耗材如擴增反應管的開放性可能會決定日常檢測成本的高低。作為臨床PCR實驗室，在選擇實時熒光PCR儀時，可考慮這一點。不過對于檢測HCV等RNA項目的時候，盡量使用去RNAnase酶耗材。
5、硬件設計特點
熒光定量PCR儀主要有96孔板式和離心式等，每種設計都有它的獨到之處，但也都有無法避免的缺陷。
96孔板的熒光定量PCR儀可以容納的樣本量大，大可至100ul，而且無需特殊的耗材。傳統的96孔板儀器多采用鹵鎢燈激發、CCD檢測。其優點在于：鹵鎢燈的光強比LED燈強，波長范圍廣，對于熒光染料的激發具有非常好的效果，性能比較穩定，使用壽命約3000個小時左右；但CCD的檢測通常會因為每個樣品孔距光源和檢測器的光程各不相同，會產生邊緣效應，對結果產生一定的影響。為了保證、的實驗結果，這類儀器在實驗過程中通常需要配合ROX校正染料，來平衡孔間差異；
離心式的儀器通常選用LED激發、PMT檢測，設計上避免了邊緣效應，同時PMT檢測對熒光信號可以放大或縮小，相對于CCD檢測更加靈活，靈敏度更高；但LED的熒光強度比較弱，波長范圍也比較窄，因此，對熒光染料的激發效果不如鹵鎢燈；
6、運行速度
在熒光定量PCR儀的眾多技術參數中，升降溫速度也是非常重要的。更快的升降溫，可以縮短反應進行的時間，而且縮短了可能的非特異性結合和反應時間，提高PCR的特異性。但是，運行速度越快，對加熱制冷模塊的要求越高，因此，穩定性是其存在的大問題，如果在市面上經過長期考證的，穩定性好的儀器，運行速度越快，帶來的便捷越多；
7、靈活性
在儀器基本性能得到保證的情況下，另外一方面則需要考慮儀器的靈活性，主要包括：儀器運輸的靈活性，拆卸的靈活性，軟件升級的靈活性，模塊更換的靈活性以及使用的靈活性等。
 
三、臨床基因擴增實驗室硬件基本要求是什么？
（1）實驗室整體布局：
根據衛生部頒發的《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》（衛醫發[2002]10號）要求，臨床基因擴增檢驗室原則上分為四個單獨的工作區域：試劑貯存和準備區，標本制備區，擴增區，產物分析區，也可以將后兩個區域合為一個區，即擴增及產物分析區。實驗室設計時按照《辦法》規定，三個區域相互獨立，并有各自的緩沖區域。
（2）各工作區域儀器設備
各工作區域的儀器設備及物品，包括椅子、辦公用品、清潔用品等均不能拿出本區域，所有可移動物品均應有本區域的標示。
各區域應具備的設備配置為：屋頂紫外燈、近臺紫外燈、一次性手套、一次性鞋套、工作服、廢液缸、掃帚、拖把、廢紙簍、微量加樣器（覆蓋1-1000ul），經高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾芯）、筆、紙等。
各工作區域的特殊配置包括：
（1）試劑貯存和準備區：2～8℃冰箱、漩渦震蕩器、超凈工作臺。
（2）標本制備：2～8℃冰箱、-20℃冰箱、高速臺式冷凍離心機、漩渦震蕩器、金屬加熱模塊、超凈工作臺。
（3）擴增及產物分析區：熒光定量核酸擴增儀、電腦、打印機。
同時：進入各工作區域必須嚴格按照單一向，并用明顯的箭頭表示，各區域用不同的顏色以示區別。即試劑貯存和設備區（藍色）→標本制備區（白色）→擴增及產物分析區（粉色）。
 
四、如何分析室內質控品的結果？
采用Levey-Jerming質控圖, 以X±2SD警告線，X±3SD為失控線。質控點落在x±3S之外時，首先采取的措施是復檢，復檢的目的主要是用于查明人為誤差，也可以查出偶然誤差，如果是偶然誤差，重測的結果應在允許范圍內。同時還在觀察標準曲線的生成情況，擴增效率的高低，曲線梯并是否良好，曲線形態是否標準，Ct值是否有飄移，還要結合臨床標本的檢測結果，是否有高值和低值，來區分是試劑造成的失控還是操作不當、儀器故障或老化造成的失控。若臨床標本測定結果的曲線標準，測量值有高有低，同時檢測的試劑空白及陰性質控均在控，很有可能是標準品質量有問題，如降解、更換試劑型號等情況發生造成的。  對于連續7個質控點落在均值之一側，若均未超出X±3s范圍時，認為存在系統誤差，但檢測結果仍可發出；若連續7個質控點落在均值之一側，而且質控數據有超出X±3s范圍的趨勢時(逐漸升高或逐漸降低)，一定要聯絡儀器工程師，及時校準儀器。
 
五、內標定量與外標定量對比？
由于傳統定量方法都是終點檢測，即PCR到達平臺期后進行檢測，而PCR經過對數期擴增到達平臺期時，檢測重現性極差。同一個模板在96孔PCR儀上做96次重復實驗，所得結果有很大差異，因此無法直接從終點產物推算出起始模板量。加入內標后，可部分消除終產物定量所造成的不準確性。但即使如此，傳統的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。
內標定量：若在待測樣品中加入已知起始拷貝數的內標，則PCR反應變為雙重PCR，他們之間存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數相差比較大時，這種競爭會表現得更為顯著。但由于待測樣品的起始拷貝數是未知的，所以無法加入合適數量的已知模板作為內標，也正是這個原因，傳統定量方法雖然加入內標，但仍然只是一種半定量的方法。
外標定量：外標法不是把標準物質加入到被測樣品中，而是與被測樣品在相同條件下進行檢測。由于在熒光定量PCR中，Ct值與起始模板的對數存在線性關系，因此可以利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，并且在PCR循環剛剛進入真正的指數擴增期時，Ct值的重現性*，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增，得到的Ct值是恒定的，因此定量的結果也會準確很多。
美國Texas大學的科研人員進行了外標法定量和內標法定量的方法學比較，得出的結論是：內標法作為定量或半定量的手段是不可靠的，而外標準曲線的定量方法是一種準確的、值得信賴的科學方法。【Ke LD, Chen Z, Yung WK.A reliability test of standard-based quantitative PCR: exogenous vs endogenous standards. Mol.Cell Probes,2000,14(2):127-135】
 
六、IU/ml和copies/ml之間單位換算關系？
首先簡單來說，IU/ml和copies/ml是沒有直接關系的，IU/ml是標準物質的表述單位，copies/ml是各檢測方法對結果的表述單位的一種，可參見李金明《實時熒光PCR技術》P177。
所謂的International Unit（IU），是為了統一各個檢測方法而設定的單位。本身PCR檢測的拷貝數是無法定量的，可以理解為，為了統一標準，WHO制定標準物質，賦予其IU值，發放給各個PCR試劑廠商，讓他們把各自檢測結果和標準物質比較，從而得出各自的換算系數。比如分發的是1IU的標準物質，羅氏測的是2copy，那羅氏的換算系數是2（2copies=1 IU），雅培的是20copy,那雅培的就是20（20copies=1 IU），由此可見，各個方法的轉換系數是不一樣的。
其次，因為各實驗方法檢測結果的表述單位存在多樣化，如copies/ml，geq/ml等，使得檢測結果沒有可比性，因而WHO應用單位IU作為統一的表述單位，使不同實驗室、不同檢測方法得出的檢測結果的表述單位得到統一并具有了可比性。
后，具體每種方法的檢測結果與IU的關系，可以通過同時檢測WHO的標準物質，然后根據其與標準物質的比例關系，來找到不同檢測方法IU與copies之間的關系。
 
實驗篇
一、“假陰性”與“假陽性”結果如何判定？
假陰性判斷：造成假陰性結果的原因有很多，主要體現在FAM擴增曲線不起來，原因包括標本抑制，核酸提取失敗，基因突變以及儀器故障等。
目前國內主流PCR試劑都不帶內標監控功能，用于檢測目標基因的FAM擴增曲線既用來定量又用于定性（判斷陰陽性），因此FAM擴增曲線的好壞非常關鍵。對于此類無內標試劑，建議結合乙肝血清標志物結果（五項定量/定性結果）來判斷陰陽性，即使是FAM曲線有擴增也應該參考此結果，特別是E抗原結果。同時，對于擁有競爭性內標監控功能的試劑來說，可有以下四種情況發生：如FAM無擴增，內標有擴增：結果正常，判斷該樣本為陰性結果；如FAM無擴增，內標也無擴增：結果異常，可能原因核酸提取失敗或有抑制，一定要重復實驗；如FAM有擴增，內標有擴增：結果正常，因為待測核酸和內標在同一反應體系下擴增；如FAM有擴增，內標無擴增：結果正常，強陽性樣本會抑制內標的擴增，導致內標結果偏弱或陰性。
假陽性判斷（如何判定）：臨床PCR檢測當中造成假陽性結果的情況比較少，原因包括試劑污染，氣溶膠污染，操作污染，擴增產物污染，非特異性擴增，耗材污染等，所以建議一定要做陰性對照來監控是否存在污染。
 
二、造成陽性樣本漏檢的可能原因有哪些？
在臨床PCR檢測中，造成陽性樣本漏檢的原因很多，其中包括實驗操作原因，試劑盒本身的原因，樣本原因等等。一：在實驗操作過程中，核酸提取丟失或失敗而導致漏檢是比較常見的原因之一，如煮沸法試劑，要經過高速離心、吸去上清及高溫煮沸等過程，很容易造成核酸的丟失，對于一些弱陽性樣本，很可能因核酸丟失造成漏檢；第二：由于試劑盒本身設計的缺陷，而導致對某種少見基因型檢測不出來情況，這是試劑盒設計的硬傷，因此檢驗者必須根據具體情況來選擇合適的試劑進行檢測；第三：操作過程中，因操作不規范，帶入一些外源性抑制物，而終導致PCR擴增失敗或擴增受抑制。可見試劑盒方法學特點以及去抑制物能力對臨床檢驗的重要性。另外，一些外源性抑制物也有可能導致擴增失敗，比如手套的滑石粉，因此建議使用無粉手套，同時也要求操作者嚴格規范實驗操作。
 
三、PCR擴增曲線中，造成不規則擴增曲線的可能原因有哪些？
實時熒光定量PCR擴增曲線包括基線期，指數擴增期，線性擴增期和擴增平臺期，標準的曲線應該呈典型的S型。
不規則曲線可以根據曲線的具體情況來分析：
1）曲線呈斜線上升
原因：熱蓋失靈或熱蓋沒蓋緊，導致控溫不準、液體揮發。
解決辦法:更換儀器熱蓋或將熱蓋蓋緊。


 
圖1 曲線呈斜線上升






2）擴增曲線分成兩段（斷裂）
 
圖2擴增曲線分成兩段（斷裂）


原因：基線的終點大于Ct值，通常是因為模板DNA濃度偏高，CT值< 15，而基線仍然取3-15，其中包含部分擴增信號，導致曲線被壓下去。
解決方法：減小基線終點，至Ct值前4個循環，重新分析數據。






3）直線擴增曲線
 
圖3 某些樣本出現直線擴增曲線


原因：探針部分降解
解決辦法:建議更換試劑進行測試。






4）曲線平臺期下掉
原因：蓋子沒蓋緊
解決辦法:PCR反應管蓋子蓋上后，檢查蓋子是否蓋緊。


 
圖4　曲線平臺期下掉






四、乙肝兩對半的大三陽標本HBV DNA檢不出怎么辦？
HBV-DNA檢查是反應乙肝病毒復制程度和傳染性大小的直接指標。臨床數據顯示，在乙肝兩對半大三陽病例  中，HBV DNA陽性的檢出率*，但HBV DNA陰性的結果也是很有可能的。一般乙肝大三陽HBV-DNA陰性雖然表明患者病毒未超標，但大三陽結果提示患者感染乙肝病毒，且具有較強傳染性。盡管如此，臨床檢驗者也可能遇到大三陽標本HBV DNA檢測不出的情況。首先對于這樣的標本，可以將標本進行稀釋后進行復查，排除血清或血漿標本中存在抑制物或者陽性標本HBV DNA濃度超過試劑盒上限而導致PCR擴增失敗的情況。其次，乙肝病毒發生變異也是導致PCR擴增不出的原因之一，通常都是用藥治療患者的乙肝病毒核酸序列發生了突變。如經過多種PCR試劑檢測失敗后，可進行DNA測序以確定乙肝病毒及其變異位點，以指導臨床醫生用藥治療。后， 可更換另一廠家試劑進行檢測，排除原試劑本身設計缺陷而造成漏檢的情況。
 
五、乙肝兩對半全陰的標本HBV DNA結果呈陽性怎么辦？
國內外文獻報道證實，乙肝兩對半標志物全陰性的病人不能排除HBV DNA感染，主要是因為HBV DNA的檢測窗口期出現早于乙肝血清標志物，因此此類患者可能處于乙肝感染早期。
乙肝感染后，在乙肝“兩對半”檢測中，表面抗原HBsAg出現早，一般在感染3周后出現，而HBV DNA的檢測能將窗口期縮短至6-15天，乙肝兩對半全陰的標本HBV DNA為陽性，是因為病人處于感染乙肝病毒的初期，免疫學的檢測窗口期比基因檢測的窗口期長，導致兩對半檢測結果為陰性，由此可知：HBV DNA的檢測，對于疾病的早期診斷有著非常重要的意義。
 
六、怎樣保證實驗室的檢測質量？
1）為了保證檢測質量，臨床PCR實驗室應有充分合理的空間，良好的照明和空調設備。工作環境雖不是檢測質量的直接原因，但寬敞舒適的實驗室環境將肯定有利于檢驗質量的保證。
2）合理有效地對儀器設備進行管理，定期做維護和校準，使其處于一個良好的狀態。例如，定期校準移液器，使其保持足夠的準確度和精密度。定期維護熒光定量PCR儀的光學系統和反應孔間溫度差異，使其保持在良好狀態和允許的范圍內。此外，還包括天平，離心機，冰箱等設備的管理。
3）理想的試劑：主要有內外兩個因素，內在因素包括標本處理方法，用于核酸擴增的原材料及方法學設計等。外出因素包括試劑盒的運輸和保存中的問題。
4）標準化操作流程：完整的臨床PCR程序由標本采集，運送，保存，編號，試劑準備，核酸提取，擴增和產物檢測，結果分析和報告等諸多環節，建立科學和與本實驗室配套的SOP文件，嚴格按SOP進行操作。
5）主要污染源和防污染措施：PCR的主要污染源有標本中的大量待測微生物，克隆質粒，大量存在實驗室中的特定微生物以及以前擴增產物的殘留污染等。這些都是實驗室容易造成假陽性的污染。因此，必須嚴格分區實驗室及遵守工作流程，使用化學清潔實驗臺面，使用紫外線照射和UNG方法消除擴增產物污染等等。
6）進行室內和室間質量控制，室內質量控制可以確保實驗室室內測定質量的一致性，室間質量控制可以提供將實驗室測定情況與一室間和客觀標準進行回顧性比較的數據。
 
七、實驗室擴增產物污染怎么辦？
答：如實驗室的擴增產物泄露，造成實驗室的污染，那么后果將非常嚴重。要去除污染，首先重要的是保持通風，保證擴增產物片段能順利擴散出去；其次可采用稀酸處理法，對可疑器具用1mol/L鹽酸擦拭或浸泡，使殘余DNA脫嘌呤；再次采用紫外照射法，紫外波長（nm）一般選擇254/300nm，需要注意的是，選擇UV作為消除殘留PCR產物污染時，要考慮PCR產物的長度與產物序列中堿基的分布，UV照射僅對500bp以上長片段有效，對短片段效果不大；后若污染長時間不能消除，建議更換另外廠家的PCR試劑進行檢測，因為每個廠家的引物設計區域不一樣；一般情況下，一家試劑公司的擴增產物不會在另外一家廠家的引物設計區域內，因此不會造成產物污染的假陽性。
 
儀器篇
一、如何判斷自己的PCR儀器熒光檢測是否正常？
要判斷自己的PCR儀器是否正常，可從以下幾方面考慮：
1.儀器開關機，與軟件連接是否正常。
2.儀器運行同樣的實驗所需要的時間是否跟平時一致，由此判斷儀器的加熱制冷模塊是否正常。
3.曲線結果是否呈明顯的S型，若曲線異常，如呈曲折上升狀，則可能是熱蓋問題，或者是熒光檢測裝置出現問題。
4.若曲線的熒光值與平時相比，明顯降低，則要考慮是否需要更換儀器光源（尤其是鹵素燈，其光源壽命約2000h）。
5.若儀器某一孔或幾孔的熒光值明顯高于其他孔位，則需要考慮儀器的孔槽或檢測光路是否受到熒光污染，建議清洗儀器孔槽后再進行測試。
 
二、PCR儀器運行中突然斷電怎么辦？
答：通常我們建議在實驗室配備UPS電源，這樣能夠保證PCR儀器運行過程中的正常供電，從而保證程序的正常運行。PCR儀器在運行中突然斷電的話，如儀器有斷電保護功能，則可直接繼續運行程序。如實驗室無UPS電源，突然斷電而導致PCR程序不能完成，為了保證實驗結果的真實性，建議只能重復實驗再上機檢測。
 
三、PCR儀器的熱蓋壞了怎么辦？
答：熒光定量PCR儀的熱蓋失效或故障主要的表現是：控溫不準和液體揮發，反應液揮發會終導致曲線不擴增，呈斜線上升。首先可通過曲線判斷熱蓋是否故障，若確定熱蓋已經壞了，建議可以在每個PCR反應管中加入一層礦物油（礦物油可避免反應液揮發），上機測試曲線結果是否正常。如曲線仍然異常，則建議請儀器工程師現場維修，甚至直接更換熱蓋。
 
四、PCR儀器有哪些常見的小問題？如何解決？
答：PCR儀器常見的小問題有如下幾點：
1.打開電源但是儀器不響應。這種情況很可能是由于電源線脫落或者沒有插緊而致，將電源線重新插入插座即可排除故障。
2.儀器和軟件無法正常連接。建議打開儀器電源，讓儀器通過自檢后，再打開軟件；因為儀器在自檢過程中，很容易導致軟件連接不上。另外，若儀器和軟件仍連接不上，檢查連接線是否插緊，再重啟軟件。
3.儀器加熱或冷卻速度緩慢。PCR反應過程的關鍵是升、降溫過程的時間控制，要求越短越好，當PCR儀的降溫過程超過60s，就應該檢查儀器的制冷系統，對風冷制冷的PCR儀要較*地清理反應底座的灰塵；對其他制冷系統應檢查相關的制冷部件，找儀器工程師進行維護。
4.熱蓋控溫失靈。這種情況可能會導致實驗運行的曲線結果很亂，不呈S型，且運行結束后，會發現PCR反應管的側壁甚至頂部有很多液滴，這樣會導致熒光采集光路發生變化，曲線結果異常。
5.儀器加熱模塊的孔槽被污染，導致一個或多個孔的熒光值很高。結果運行完成后，發現某個孔位的熒光值本底明顯高于其他孔位，則要考慮該孔是否被污染，對儀器孔槽進行清潔。先打開蓋子，然后用無水乙醇浸泡樣品池5min，然后用移液器吸去液體，再加入去離子水進行二次清潔，用移液器吸去液體；打開PCR儀，設定保持溫度為50℃的PCR程序并使之運行，讓殘余液體揮發去除，一般5～10min即可。
 
五、PCR反應管上面做標記對結果有何影響？
答：我們不建議在PCR反應管上用記號筆做任何標記。據李金明教授的《實時熒光PCR技術》一書上的P100記載：反應管用記號筆做標記，加熱將使顏料揮發，進而污染光路部分影響檢測。
 
六、PCR反應管為什么不放在儀器孔槽的邊緣？
答：主要原因大致分為一下兩點：
①CCD檢測系統：對于采用CCD檢測系統而不是PMT或者其他檢測系統的熒光定量PCR儀器來說，由于曝光和成像原理，使得采集到的信號中間強，兩邊弱，即我們常說的邊緣效應，因此對于此系統，將反應管放在儀器中間是比較好的；
②對于采用熱蓋加熱或保溫的儀器，如果PCR管單獨放在儀器孔槽的一邊，容易讓熱蓋傾斜，也會對實驗產生細微的影響，因此放中間也好些。
 
雅吉生物篇
一、雅吉生物HBV一步法操作過程有什么需要注意的地方？
答：操作雅吉生物HBV一步法主要有如下需要注意的地方：
1.使用校準過的移液槍，建議取核酸釋放劑和樣本的移液器量程大為10ul，加反應液的移液器量程大為100ul。
2.加核酸釋放劑可以使用一個移液槍頭，建議采用深吸淺打的連續加樣方式（具體操作方式見后圖說明）。
3.標準品和樣本使用前先混勻并瞬時離心，加標本或標準品的時候，加一個樣換一個槍頭，建議槍頭伸到底部吹打3次，力度均勻避免產生氣泡。
4.加完標本或標準品并吹打三次后，建議等待10分鐘后再加反應液，如一次做的標本量在32個以上則不需要等待。
5.加反應液的時候，加一個樣本換一個移液槍頭，避免污染！槍頭需伸入到八連管內部靠壁加入，不要懸空加。
6.樣本和反應液都可以采用淺吸深打的加樣方式（具體操作方式見后圖說明）。
7.加完反應液后，無需等待，蓋上蓋子，即可上機。
  


移液器的兩個檔位：1檔、2檔
a.核酸釋放劑深吸淺打：調節移液器至5ul，吸液時按到2檔，伸入核酸釋放劑的試劑管中，松開移液器，即取到液體。將核酸釋放劑加入八連管中時，按到1檔打出去，此時打出去的液體剛好為5ul。手不要松開，此時槍頭中還剩下一部分液體，再將此槍頭伸入試劑管中松開，即第二次取液，按1檔將液體打入八連管，如此下去將核酸釋放劑均加入八連管。到后一個孔時還剩余小部分核酸釋放劑，可以舍棄掉，如確定沒有被污染，可以打回試劑管中。
b.樣本和反應液淺吸深打：即常規的加液方式，加樣本時，調節移液器至5ul（若是反應液則是40ul），吸液時按到1檔，伸入試劑管中，松開移液器，取到液體。將試劑加入八連管中時，按到2檔*將液體打出去。換一個槍頭加其他的樣本或試劑。
 
二、HBV一步法加5ul樣本是否太少了？
答：傳統的煮沸法過程是：取100ul血清樣本與100ul處理液A，經高速離心、濃縮去上清后，加入25ul處理液B，后取2μl DNA提取物上樣；通過反推法，煮沸法相當于取了8μl原始樣本。我們綜合考慮煮沸法的提取過程，首先，在高速離心濃縮病毒時，對于高濃度的樣本，病毒沉淀不*，容易造成一次核酸丟失；其次，在去除上清液的過程中，因為我們無法清楚地看到離心管中的沉淀，槍頭極有可能碰到底部的病毒，導致帶出病毒，造成核酸的第二次丟失；再次，在高溫加熱煮沸過程中，蛋白質高溫變性，成為凝膠狀，可能導致在第三步的高速離心中，凝膠狀的蛋白包裹核酸，沉降到離心管底部，造成核酸的第三次丟失。綜合可知：煮沸法的8ul上樣量是不準確、不真實的。
反觀一步法，其原理是取5ul核酸釋放劑和5ul血清，直接加到PCR反應管中，病毒裂解，核酸釋放出來。核酸釋放劑的裂解作用非常強烈，能夠使核酸*釋放出來，核酸無需進行提取，沒有損失，5ul血清中的病毒全部進入擴增，保證了定量的準確性。
 
三、磁珠法的原理是什么？
磁珠法是采用納米磁珠提取血清或血漿樣品經裂解后釋放出的的核酸，利用針對核酸保守區設計的一對特異性引物、一條特異熒光探針，配以PCR反應液，在熒光定量PCR儀上，應用實時熒光定量PCR檢測技術，通過熒光信號的變化實現核酸的定量檢測。簡單步驟：加溶液1→加樣本→加溶液2→棄廢液→加溶液3和4→棄廢液→加反應液上機。核酸提取溶液1含十二烷基*、曲拉通X-100、異硫氰酸胍等主要是裂解、釋放核酸的作用；核酸提取溶液2內含磁珠顆粒，磁珠經過特殊的修飾，能夠特異性吸附核酸。溶液3主要是無機溶液，主要是清洗吸附了核酸的磁珠，去除雜質。溶液4為礦物油，能夠去除能溶于有機相的雜質，同時，在去除廢液時，能更好的排除溶液3對擴增的影響。
 
四、ROX校正有何作用？
答：通常我們在進行PCR的操作時，無法保證每個樣本的加樣量是*一致的，每個樣本之間都會有細微的差別，同時，因為儀器的溫控和光源系統都會存在不同程度的邊緣效應，導致模塊的每個孔間都存在差異。反應液中ROX的濃度是固定的，因此其信號的強度與反應體系的總體積和總的熒光激發效率正相關，因此ROX可用于消除用槍操作誤差、耗材PCR反應管的管蓋、管壁的厚度差異，同時可校正儀器的孔間溫差以及光源的邊緣效應造成的光學誤差，減少孔間差異，提高數據重現性和度，使定量更準確。