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什么是基因敲除細胞（KO 細胞）？
基因敲除細胞（KO細胞） 是指在特定細胞中人為刪除或失活某個基因 ，從而使該細胞不再表達該基因編碼的蛋白質的細胞系。常用的方法如CRISPR-Cas9技術：利用Cas9核酸酶在目標基因處產生雙鏈斷裂，隨后通過非同源末端連接（NHEJ）導致框移突變，使基因失活。
CRISPR-U™ 是源井生物自主研發的高效細胞基因編輯平臺，基于 CRISPR/Cas9 技術，結合獨特的 gRNA 設計算法、豐富的細胞系編輯參數數據庫、精確的 Pool 編輯效率檢測方法、單克隆形成率提升策略，以及適用于微量細胞的高通量基因型鑒定體系。在基因敲除細胞系構建方面，源井生物自主研發的 CRISPR-U™ 技術相較于傳統方法,可將基因編輯效率提升 10–20 倍。
為什么要做KO細胞？
與普通細胞相比，KO 細胞的核心價值在于：通過 “去除" 某個基因，觀察細胞在生理、病理狀態下的表型變化（如增殖、凋亡、代謝異常等），進而反向推導該基因的生理功能，或明確其在疾病發生發展中的作用。
簡單來說，KO 細胞就像 “基因功能的放大鏡"—— 當某個基因被 “關閉" 后，細胞出現的異常變化，往往就是這個基因原本負責調控的生理過程，為科研人員提供直接的研究線索。
KO 細胞如何構建？
目前主流的KO 細胞構建策略以 CRISPR/Cas9 技術為主，其原理是借助 gRNA 對靶序列的特異性識別，引導 Cas9 核酸內切酶在靶序列的 PAM 基序上游完成精準切割，造成靶位點 DNA 雙鏈斷裂；隨后細胞啟動自身的 DNA 損傷修復應答機制，將斷裂的 DNA 上下游末端直接連接，最終實現目標基因的功能敲除。
（一）通用構建流程：四步完成 KO 細胞制備
1.目標基因與靶點設計
首先明確研究目標（如敲除某致癌基因、代謝相關基因），通過基因數據庫（如 NCBI、Ensembl）獲取目標基因的全長序列，選擇外顯子區域（尤其是編碼起始區或關鍵功能域） 作為編輯靶點 —— 此處敲除可zui大程度確?；蚴Щ?，避免產生截短的功能性蛋白。
【小Tips】：可以選擇的情況下，敲除區域需要覆蓋所有轉錄本，如果無法選擇，優先考慮主要轉錄本 (有CCDS編號的，NM開頭的)
2.基因編輯工具導入
根據選擇的技術（如 CRISPR/Cas9），構建含靶點序列的編輯載體（如 sgRNA 載體 + Cas9 蛋白 / 載體），通過轉染（脂質體轉染、電穿孔）或病毒感染（慢病毒、腺病毒）的方式，將編輯工具導入宿主細胞（常見如 HEK293T、Hela、RAW264.7 等細胞系）。
【小Tips】：推薦使用源井紅棉·CRISPR基因編輯系統設計sgRNA，系統集成“基因風險評估"、“表達量評估"、“拷貝數評估"等輔助小工具，可實現實驗方案的一鍵化風險與難度評估，有效提升基因編輯設計效率與成功率。
3.陽性細胞篩選
編輯工具導入后，僅有部分細胞會發生目標基因敲除，需通過篩選標記（如抗生素抗性基因、熒光蛋白基因）篩選陽性細胞：
短期篩選：使用對應抗生素（如嘌呤霉素、潮霉素）培養，淘汰未導入載體的細胞；
單克隆分選：通過有限稀釋法或流式細胞分選，獲得單個陽性細胞克隆，確保后續細胞的基因一致性。
4.敲除效果驗證
這是關鍵一步，根據需求選擇多層級驗證確認基因已成功敲除：
基因型驗證：采用 PCR 擴增目標基因區域，結合測序或電泳，確認基因片段是否缺失；
蛋白水平驗證：通過 Western Blot 檢測目標蛋白的表達量，若蛋白wan全不表達，說明敲除成功；
表型驗證：觀察細胞是否出現預期表型（如敲除凋亡抑制基因后，細胞凋亡率升高），進一步確認敲除有效性。
