ICG 標記多肽的核心是通過氨基（或巰基）偶聯反應實現共價結合，關鍵在于控制反應條件和高效純化。

一、實驗核心準備

1. 試劑準備：純度≥95% 的目標多肽（含游離氨基 / 巰基）、ICG-NHS 酯（或 ICG - 馬來酰亞胺，匹配多肽反應基團）、無水 DMSO、無氨基緩沖液（如 PBS pH 7.2-7.4）、淬滅劑（如甘氨酸）。

2. 器材準備：避光離心管、磁力攪拌器、透析袋（MWCO 3.5-10 kDa）或 HPLC 系統、冷凍干燥機、紫外 - 可見分光光度計。

3. 多肽預處理：用無水 DMSO 溶解多肽，濃度調整為 1-10 mg/mL，確保無水分干擾反應。

二、標記反應步驟

1. 按多肽與 ICG 摩爾比 1:1.2-1:2 投料，將 ICG-NHS 酯用少量無水 DMSO 溶解后，緩慢滴入多肽溶液。

2. 室溫下避光攪拌反應 2-4 小時，或 4℃過夜，全程避免光照和氧氣接觸。

3. 加入過量甘氨酸（終濃度 10 mM），繼續攪拌 30 分鐘，淬滅未反應的 ICG 活性基團。

三、產物純化與收集

1. 透析法：將反應液轉入透析袋，用 PBS 緩沖液 4℃避光透析 24-48 小時，每 6-8 小時更換一次緩沖液，去除游離 ICG。

2. 高效液相色譜（HPLC）法：采用反相 C18 柱，以乙腈 - 水（含 0.1%TFA）為流動相梯度洗脫，收集目標峰（通過 280 nm 和 780 nm 雙波長檢測確認）。

3. 冷凍干燥：將純化后的溶液冷凍干燥，得到 ICG 標記多肽粉末，避光密封保存。

四、關鍵驗證步驟

1. 純度檢測：HPLC 檢測目標峰純度≥90%，無明顯游離 ICG 雜峰。

2. 標記率計算：通過紫外 - 可見分光光度計分別測定 280 nm（多肽）和 780 nm（ICG）吸光度，按公式計算標記率（理想值 0.8-1.2）。

3. 穩定性驗證：將標記產物溶于 PBS，4℃避光放置 1 周，檢測吸光度變化，確認無明顯降解。