一、NHS 酯與氨基（-NH?）的反應機制（酰胺化反應）

1. 親核進攻：氨基（-NH?）中氮原子帶孤對電子，作為親核試劑進攻 NHS 酯的羰基碳（活性酯羰基碳電子云密度低）。

2. 四面體中間體形成：羰基碳接受親核進攻后，電子云重排形成不穩定的四面體中間體。

3. 離去基團脫離：中間體快速分解，NHS（琥珀酰亞胺）作為離去基團脫離，同時形成穩定的酰胺鍵（-CO-NH-）。

4. 反應終產物：目標分子（如多肽 / 蛋白）通過酰胺鍵與標記物（如 ICG）共價連接，副產物為游離 NHS（水溶性，易通過純化去除）。

二、實驗關鍵關聯要點

• 反應條件：NHS 酯與 - NH?反應需 pH 7.2-8.0（弱堿性），此時氨基呈 - NH?形式，親核活性高；pH＜7 會降低反應速率，pH＞8 易導致 NHS 酯水解。

• 競爭雜質：體系中游離氨基（如 Tris 緩沖液、甘氨酸）會與目標分子競爭反應，需使用無氨基緩沖液（如 PBS）。

• 羧基偶聯邏輯：若需連接羧基，需先用水溶性縮合劑（EDC）活化羧基，再加入 NHS 生成穩定的 NHS 酯中間體，最后與氨基反應（兩步法）。