PEG-b-PMMA 膠束載紫杉醇實驗步驟

一、材料與儀器準備

1. 主要材料

• PEG-b-PMMA 嵌段共聚物 (PEG 分子量：5k-20kDa, PMMA 分子量：10k-50kDa)

• 紫杉醇 (PTX, 純度> 95%)

• 無水甲醇 / 乙醇 / 氯仿 / 二氯甲烷 (分析純)

• 磷酸鹽緩沖液 (PBS, pH=7.4, 0.01M)

• 超純水 (Milli-Q 級)

2. 儀器設備

• 旋轉蒸發儀 (配真空系統)

• 恒溫磁力攪拌器

• 超聲儀 (功率可調)

• 透析袋 (MWCO:3.5kDa 或 10kDa)

• 0.22μm 或 0.45μm 微孔濾膜 (水系)

• 冷凍干燥機 (凍干機)

• 動態光散射儀 (DLS, 測粒徑和 PDI)

• 透射電子顯微鏡 (TEM, 觀察形態)

• 高效液相色譜儀 (HPLC, 測載藥量和包封率)

二、PEG-b-PMMA 膠束載紫杉醇制備方法

方法一：薄膜水化法 (推薦)

• 稱取 PEG-b-PMMA 共聚物 50-100mg 和紫杉醇 5-10mg (藥物：聚合物 = 1:10-1:20, w/w)

• 加入 5-10mL 有機溶劑 (甲醇：氯仿 = 1:1 或純氯仿)

• 30-40℃超聲溶解 15-30 分鐘，直至形成澄清透明溶液

• 將溶液轉移至茄形燒瓶，40-60℃旋轉蒸發 (150-200rpm) 除去有機溶劑，形成均勻透明薄膜

• 繼續真空干燥 1-2 小時，確保溶劑去除

• 加入 5-10mL 預熱至 40-60℃的 PBS 或超純水

• 30-60℃恒溫磁力攪拌 (200-300rpm) 30-60 分鐘，使薄膜水化形成膠束溶液

• 將膠束溶液通過 0.45μm 濾膜過濾，除去未溶解雜質

• 裝入透析袋，在 PBS 或水中透析 (4℃, 12-24 小時，換水 3-5 次), 除去游離藥物和殘留溶劑

• 透析后的膠束溶液可通過超濾 (10kDa 截留分子量) 濃縮至所需濃度

• 或直接冷凍干燥 (預凍 - 80℃, 凍干 - 35℃, 15Pa) 制成凍干粉，4℃保存

方法二：透析法 (適合小批量)

• 稱取 PEG-b-PMMA 共聚物 (50-100mg) 和紫杉醇 (5-10mg) 溶于 5mL DMF 或 DMSO

• 將溶液轉移至透析袋 (MWCO=3.5kDa), 置于 500mL PBS 或水中

• 室溫磁力攪拌 (100-200rpm) 透析 24-48 小時，期間換水 3-5 次

• 透析結束后，取出膠束溶液，0.22μm 濾膜過濾，即得載藥膠束

三、PEG-b-PMMA 載藥膠束表征

1. 粒徑與形態表征

• 稀釋膠束溶液至 0.1-0.5mg/mL

• 25℃測量，每個樣品測 3 次，每次 10-20 個循環

• 記錄平均粒徑、PDI (多分散指數，應 < 0.3 表示單分散性好)

• 滴 1-2 滴稀釋后的膠束溶液 (0.1mg/mL) 于碳支持膜銅網上

• 室溫風干或 30-40℃烘干 (約 20 分鐘)

• 用 2% 磷鎢酸負染 30 秒，濾紙吸干多余染液

• 觀察并拍照，記錄膠束形態 (應為規則球形)

2. 載藥量 (DL) 與包封率 (EE) 測定

• 色譜柱：C18 柱 (250mm×4.6mm, 5μm)

• 流動相：甲醇：水 = 65:35 (v/v) 或乙腈：水 = 50:50 (v/v)

• 流速：1.0mL/min, 柱溫：30℃, 檢測波長：227nm

• 進樣量：10-20μL

• 精密稱取紫杉醇標準品適量，用甲醇配制成系列濃度 (1, 5, 10, 20, 50, 100μg/mL)

• 進樣測定，以峰面積對濃度作圖，得到標準曲線

1. 取適量載藥膠束溶液 (W_total, mg), 加入等體積甲醇破乳，超聲 15 分鐘

2. 12000rpm 離心 15 分鐘，取上清液，0.22μm 濾膜過濾

3. HPLC 測定上清液中紫杉醇濃度，計算載藥膠束中紫杉醇總量 (W_drug, mg)

4. 載藥量 (DL, %) = (W_drug/W_total) × 100%

5. 包封率 (EE, %) = (W_drug/W_drug 理論) × 100%, 其中 W_drug 理論為投料量

3. 體外釋放研究

• 取 1-2mL 載藥膠束溶液 (1mg/mL) 裝入透析袋 (MWCO=10kDa)

• 置于 50mL 釋放介質 (如 PBS pH7.4 或 pH5.5 含 0.1% Tween-80) 中

• 37℃恒溫振蕩 (100rpm)

• 分別在預設時間點 (0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72h) 取 500μL 釋放介質，同時補充等體積新鮮介質

• 樣品經 0.22μm 濾膜過濾，HPLC 測定釋放介質中紫杉醇濃度

• 計算累積釋放率: 累積釋放率 (%) = (釋放介質中藥物總量 / 載藥膠束中藥物總量) × 100%

四、關鍵參數優化與注意事項

1. 配方參數優化

2. 操作注意事項

• 溶劑選擇: 紫杉醇在氯仿、二氯甲烷中溶解度高，但要全部除去

• 除氧: 反應體系盡量避免氧氣，可在氮氣保護下操作

• 溫度控制: 紫杉醇在 60℃以上可能降解，薄膜蒸發溫度不宜超過 60℃

• 攪拌速度: 水化過程攪拌速度適中 (200-300rpm), 避免產生過多泡沫

• 透析: 必須充分透析除去游離藥物，否則影響載藥量計算和藥效

五、應用示例：體外抗腫瘤活性測試 (MTT 法)

1. 取對數生長期腫瘤細胞 (如 HeLa、MCF-7), 調整濃度至 5×10^4 cells/mL

2. 96 孔板每孔接種 100μL 細胞懸液，37℃、5% CO?培養 24 小時

3. 吸棄培養基，加入含不同濃度載藥膠束的新鮮培養基 (紫杉醇終濃度：0.1, 1, 10, 100ng/mL)

4. 同時設置空白對照組 (不含藥物的膠束) 和游離紫杉醇對照組

5. 培養 48-72 小時后，每孔加入 20μL MTT 溶液 (5mg/mL), 繼續培養 4 小時

6. 吸棄上清，每孔加入 150μL DMSO, 振蕩 10 分鐘使結晶溶解

7. 酶標儀測定 570nm 處吸光度，計算細胞存活率:

   細胞存活率 (%) = (實驗組 OD 值 / 對照組 OD 值) × 100%

8. 計算 IC??值 (抑制 50% 細胞生長的藥物濃度) 評估抗腫瘤活性

六、總結與后續方向