PAMAM G1-COOH EDC/NHS 偶聯氨基蛋白 / 抗體實驗步驟

一、所需試劑 & 緩沖液

1. 緩沖液配制

1. 0.1 M MES 緩沖液 pH 5.2（羧基活化專用）

2. 0.01 M PBS pH 7.4（偶聯、洗滌、復溶）

3. 封閉液：PBS 含 1% BSA

2. 試劑

• PAMAM G1-COOH

• EDC?HCl（現配現用）

• NHS（現配現用）

• 待偶聯含氨基分子：鏈霉親和素 / 抗體 / 氨基化微球

二、推薦投料摩爾比

三、詳細操作步驟

1. 配制 PAMAM 母液

   把 PAMAM G1-COOH 用 MES pH5.2 配成 1～5 mg/mL 溶液。
2. EDC/NHS 活化羧基

   按比例加入固體 / 新鮮配制的 EDC、NHS，

   室溫避光攪拌 30～45 min。
3. 緩沖液置換

   活化結束后，用超濾管 / 透析袋（MWCO 1000 Da）

   置換到 PBS pH7.4，去除多余 EDC/NHS。
4. 偶聯反應

   按摩爾比加入氨基化蛋白 / 鏈霉親和素 / 氨基微球，

   室溫溫和攪拌 2 h 或 4 ℃ 過夜。
5. 封閉未反應羧基

   加入終濃度 1% BSA，室溫封閉 30 min，

   封閉殘留活性酯，降低非特異性吸附。
6. 純化

• 偶聯蛋白：透析 / 超濾 反復洗滌 3 次

• 偶聯微球：離心棄上清，PBS 洗滌 3～5 次

  除去未結合游離蛋白，4℃保存。

四、關鍵控制要點

1. 活化必須 pH 5.0～5.2，偏離會大幅降低偶聯效率；

2. EDC/NHS現配現用，遇水易水解失效；

3. 全程避光，避免 PAMAM 結構降解；

4. 不使用含胺類緩沖液（Tris、HEPES），會競爭消耗活化基團；