mPEG-Biotin 氨基蛋白標準標記方案（EDC/NHS 活化法）

一、試劑與耗材準備

1. 原料

• mPEG-Biotin（推薦 2k/5k，分子量按需）

• 待標記蛋白（抗體 / 重組蛋白，濃度 1–10 mg/mL）

• EDC·HCl、NHS

2. 緩沖液

1. 活化緩沖液（0.1 M MES pH 5.5，無氨基！禁用 Tris、甘氨酸）

2. 反應終止緩沖液：0.1 M Tris-HCl pH 7.4

3. 純化緩沖液：PBS pH 7.2

3. 耗材

二、摩爾配比參考（關鍵）

三、操作步驟

步驟 1：蛋白緩沖液置換

步驟 2：活化 mPEG-Biotin（現配現活化，避光）

1. 稱取 mPEG-Biotin 溶于 MES 緩沖液；

2. 依次加入 NHS，混勻，再加 EDC；

3. 室溫避光攪拌活化 15–20 min；

注意：活化超過 30 min 活性酯水解，效率大幅下降。

步驟 3：蛋白偶聯反應

• 體系總體積控制 100–1000 μL

• 室溫避光反應 2 h，或 4 ℃過夜（溫和標記，保護活性蛋白）

步驟 4：終止未反應活性酯

步驟 5：分離游離 mPEG-Biotin（純化）

1. 超濾離心法（快速）

    

   選用合適 MWCO 超濾管，PBS 反復洗滌 5–6 次，除去未結合游離 mPEG-Biotin；

2. 透析法（溫和，易放大）

    

   透析袋 4 ℃避光透析 PBS，每 4 h 換液，透析 24 h 去除游離 PEG。

步驟 6：樣品分裝保存

四、標記效率簡易檢測（HABA 法）

1. 配制 HABA / 親和素工作液；

2. 梯度稀釋標記后蛋白，測 500 nm 吸光度；

3. 對照未標記蛋白計算：平均每個蛋白結合的 mPEG-Biotin 分子數，理想值 2–6 個 / 蛋白。

五、常見問題與優化

1. 標記效率極低

    

   • 緩沖液含氨基雜質，換純 MES；

   • EDC/NHS 失效，現配新鮮活化劑；

   • 活化時間過長，控制在 20 min 內。

2. 蛋白團聚失活

    

   • 降低 mPEG-Biotin 投料比（降至 3 eq）；

   • 全程 4 ℃低溫反應，縮短反應時間；

   • 提高蛋白濃度，減少試劑局部高濃度。

3. 背景很高（后續 WB / 流式）

    

   • 充分透析去除游離 mPEG-Biotin；

   • 選用高分子量 mPEG（5k/10k），抗非特異性吸附更強。

六、儲存提示

1. EDC 易吸潮，干燥避光 - 20 ℃保存；

2. mPEG-Biotin 干粉 - 20 ℃密封干燥避光，水溶液當日用完；

3. 全程避免強光，生物素結合位點遇強光易降解。