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抗體藥物偶聯物（ADC）是一類生物分子，通常由單克隆抗體（mAb）通過化學連接子與小分子藥物結合而成。ADC 屬于靶向治療藥物，其抗體部分可靶向結合細胞表面的抗原，將藥物遞送至靶點部位。盡管這類療法目前主要用于治療癌癥，但該領域的應用范圍正逐步拓展至其他疾病靶點。蛋白濃度和藥物抗體比（DAR）可用于全程監控抗體藥物偶聯物的生產制造過程。

抗體藥物偶聯物的生產制造要點

01切向流過濾（TFF）是生物分子純化過程中的常用技術。該技術可通過滲透液去除小分子物質，同時截留大分子物質，并將其隨截留液回流至料液體系中（見圖 1）。切向流過濾主要包含兩種操作模式：滲濾（DF）和超濾（UF）。滲濾可在維持料液濃度不變的前提下，通過滲透液去除小分子物質，在抗體藥物偶聯物生產中，滲濾技術可用于緩沖液置換、將偶聯蛋白轉移至新的緩沖液體系，以及去除多余的小分子物質。超濾則是對生物分子進行濃縮的工藝，緩沖液可透過濾膜，而蛋白質、偶聯物等大分子物質會被截留，從而實現料液體積減小、蛋白濃度提升的效果。

圖 1：切向流過濾工藝示意圖

研究人員通常會設定固定的滲濾體積倍數（DV），并在指定時間點取樣，以此評估游離藥物的清除效果和緩沖液置換情況。但這種方式需對數據進行回顧性分析，導致實驗操作與數據分析之間存在延遲。同時，該方法還可能造成時間和資源的浪費,因為實際游離藥物的清除可能在設定的滲濾體積倍數完成前就已實現；反之，若設定的滲濾體積倍數無法實現游離藥物的有效清除，實驗則需要重新進行。因此，在工藝開發階段，必須確定合理、可靠的滲濾體積倍數。

在超濾過程中，為達到目標藥物濃度，需對蛋白濃度進行精準監控。傳統操作中，研究人員通常在超濾完成后取樣檢測，但離線分析耗時較長，會造成工藝延遲。此外，操作人員在獲得離線分析結果前，無法判斷蛋白質是否透過濾膜，這可能導致樣品的大量損失或進一步的工藝延誤。

有一種解決方案是采用在線紫外 - 可見（UV-vis）光譜法測定蛋白質和藥物濃度，前提是該藥物在紫外 - 可見光譜區具有吸光特性。

但傳統在線紫外 - 可見傳感器的動態檢測范圍有限，原因在于紫外 - 可見吸光度同時取決于樣品濃度和光程長度。同樣，固定光程傳感器在濃度較高時，一旦總吸光度超出傳感器檢測極限，往往就會出現信號飽和現象。

可變光程技術（VPT）是一項應用于紫外 - 可見分光光度法的技術，其核心是基于朗伯 - 比爾定律推導而來的斜率光譜公式。瑞普利金公司（Repligen）的 PATsmart SoloVPE Plus 和 FlowVPX 系統均采用了該技術，通過逐步減小光程并采集 5~10 個數據點繪制斜率曲線，確定最佳吸光度值，再結合用戶提供的物質消光系數計算濃度。其中，在線 FlowVPX 儀器約每 10 秒完成一次檢測，可實現濃度和藥物抗體比的實時監控；開啟模擬輸出信號后，該系統可形成反饋回路，無需人工干預即可實現工藝的自動控制。

案例研究

02本研究旨在實現以下目標：在滲濾和超濾過程中，監控料液管路中的蛋白濃度和藥物抗體比；監控滲透液管路中的游離藥物清除情況；對比 FlowVPX 系統與成熟的 SoloVPE 方法的檢測數據。為達成上述目標，研究共使用兩套 FlowVPX 系統 —— 一套安裝在料液管路，用于監控藥物抗體比和抗體藥物偶聯物濃度；另一套安裝在滲透液管路，用于追蹤藥物清除過程。

材料與方法03研究同時對兩套配備 3mm 一次性流通池的 FlowVPX 系統和一套 SoloVPE 系統進行了測試。本研究未啟用 FlowVPX 系統的模擬信號功能，所有實驗數據均通過 CTech ViPER ANLYTX 軟件記錄。

實驗所用抗體藥物偶聯物由單克隆抗體、藥物及市售連接子偶聯而成，初始濃度為 5 mg/mL，藥物抗體比為 4。為模擬偶聯反應后體系中常見的游離藥物水平，研究人員向該抗體藥物偶聯物溶液中加入 1.1 mM 藥物溶液，使體系中游離藥物當量達到 3.2，以便監控游離藥物的清除過程。滲濾過程中，研究人員通過控制向料液中添加緩沖液的量來調節蛋白濃度，同時利用 FlowVPX 系統對蛋白濃度進行實時監控。實驗裝置見圖 2。

圖 2：實驗裝置示意圖（TFF = 切向流過濾，VPX=FlowVPX 系統）

蛋白濃度可通過對朗伯 - 比爾定律公式（公式 1：A=ε×C×l）變形推導得出（公式 2：c=A÷(ε×l)），其中，A為吸光度，ε為摩爾消光系數，c為濃度，l為光程。若考慮稀釋倍數（DF），則計算公式為公式 3：C=(A×DF)÷(ε×l)。

藥物抗體比的計算需通過聯立方程分別得出藥物（cdrug）和蛋白質（cmAb）的摩爾濃度，其中λ(drug)為藥物 - 連接子的特征吸收波長，計算公式如下：

公式 4：

cmAb=(A280εdrugλ(drug)?Aλ(drug)εdrug280)÷[(εmAb280εdrugλ(drug)?εmabλ(drug)εdrug280)×l]

公式 5：

cdrug=(A280εmabλ(drug)?Aλ(drug)εmab280)÷[(εdrug280εmAbλ(drug)?εdrugλ(drug)εmAb280)×l]

藥物抗體比的計算公式為公式 6：DAR=cdrug÷cmAb。

斜率光譜技術對朗伯 - 比爾定律進行了改進，將光程項（l）移至公式左側，得到公式 7：A÷l=ε×C。

吸光度與光程數據經回歸分析得到線性方程（公式 8：A=m×l+b），其中m為回歸直線的斜率，b為線性方程的縱截距。回歸方程中斜率項的單位為吸光度 / 光程，即吸光度 / 毫米（Abs/mm），因此可直接將公式 7 中的A÷l替換為公式 8 中的斜率項m，進而得到斜率光譜公式（公式 9：m=ε×c）。

FlowVPX 系統采集的吸光度 - 光程數據經線性回歸分析后，可通過公式 9 計算樣品濃度，且軟件會將每次的濃度檢測結果繪制成圖，實現濃度的實時監控。

除斜率值外，FlowVPX 系統的線性回歸分析還會給出決定系數（R2），該參數可反映檢測數據的線性程度，驗證其是否符合朗伯 - 比爾定律，是 FlowVPX 系統所有檢測結果的實時內置質量驗證指標。本研究中 SoloVPE 系統的檢測參數與 FlowVPX 系統保持一致，且所有樣品均進行三次平行檢測。

結果與討論04藥物清除：研究人員將 5 mg/mL 的抗體藥物偶聯物溶液加入料液儲罐并進行循環，耗時約 40 分鐘，完成蛋白濃度和游離藥物的基線校準。隨后向體系中加入 1.1 mM 游離藥物（3.2 當量），模擬偶聯反應后的游離藥物水平，使體系的藥物抗體比從 4 提升至 7。料液管路的 FlowVPX 系統可監控到抗體藥物偶聯物濃度的變化和藥物抗體比的升高，而滲透液管路的 FlowVPX 系統則可檢測到添加的游離藥物開始進入滲透液的時間點。隨著滲透液管路的紫外 - 可見吸光度下降，研究人員可實現對游離藥物清除過程的監控。

圖 3 為滲透液管路（上）和料液管路（下）在兩個特征波長下的吸光度檢測數據，其中紅線代表游離藥物濃度，綠線代表抗體藥物偶聯物濃度。結果顯示，加入游離藥物約 15 分鐘后，滲透液中開始檢測到藥物，約 130 分鐘后藥物濃度達到峰值；在隨后的 100~150 分鐘內（約 2 個滲濾體積倍數），藥物吸光度持續下降，表明游離藥物正在被清除，紅線與橫軸之間的面積代表被清除的藥物總量。研究發現，2 個滲濾體積倍數可清除約 70% 的游離藥物，且隨著體系中游離藥物濃度降低，清除速率會逐漸減慢，通常需 8~10 個滲濾體積倍數才能實現游離藥物的清除。

圖 3：ViPER 軟件繪制的滲透液和料液管路檢測數據圖（紅線為游離藥物濃度，綠線為抗體藥物偶聯物濃度；DV = 滲濾體積倍數）

料液管路中游離藥物的添加在 50 分鐘前完成，表現為藥物吸光度的急劇上升。在整個滲濾過程中，由于游離藥物被不斷清除，抗體藥物偶聯物與藥物的斜率差值逐漸增大。圖 4 為藥物抗體比隨檢測周期數的變化曲線（1 個檢測周期對應 1 次濃度檢測），結果顯示，加入游離藥物后，藥物抗體比從 4 提升至 7，2 個滲濾體積倍數后，體系最終藥物抗體比為 4.8。

圖 4：藥物抗體比隨檢測周期數的變化曲線

滲濾過程中，研究人員通過在料液儲罐上標記刻度線，控制緩沖液的添加量以維持料液體積穩定，進而實現蛋白濃度的控制。研究人員在指定時間點從儲罐中取樣，采用已建立的 SoloVPE 方法檢測，將所得數據與 FlowVPX 系統的檢測數據進行對比，結果見表 1。兩套系統檢測結果的一致性通過公式 10 計算：Agreement = (FlowVPX data ÷ SoloVPE data) × 100%

表 1：FlowVPX 與 SoloVPE 系統的蛋白濃度檢測數據（DF = 滲濾，DV = 滲濾體積倍數，eq = 當量）

抗體藥物偶聯物濃度：在另一組實驗中，研究人員評估了 FlowVPX 系統監控蛋白濃度的能力,向儲罐中加入定量的抗體藥物偶聯物，隨后依次進行濃縮和稀釋操作；每次濃縮操作均通過打開滲透液管路、關閉緩沖液進料泵實現。表 2 為濃縮和稀釋操作的步驟概述，料液管路的 FlowVPX 系統對每一步操作進行全程監控；由于料液體積較小，研究人員從截留液管路取樣，采用 SoloVPE 系統檢測并與 FlowVPX 系統的結果對比，蛋白濃度的檢測值和理論值見表 3。圖 5 為 FlowVPX 系統在濃縮和稀釋過程中的實時檢測數據。

表 2：超濾操作步驟

表 3：FlowVPX 與 SoloVPE 系統的超濾檢測數據

圖 5：FlowVPX 系統在濃縮和稀釋過程中的實時檢測數據（紅線為游離藥物濃度，綠線為抗體藥物偶聯物濃度）

蛋白濃度的理論值需在已知料液體積的前提下才能準確計算，濃度（c）與體積（v）的關系遵循公式 11：c1×v1=c2×v2。

研究人員計算了 UF1、UF2 和 UF6 樣品的蛋白濃度理論值，其中 UF6 樣品因操作誤差被過度濃縮 5%，這也是 FlowVPX 系統的檢測值略高于理論值的原因。檢測值與理論值之間的偏差還可能與流速過慢有關，此外，取樣時料液體系若未混勻，也會造成檢測偏差。

FlowVPX 系統的檢測值與 SoloVPE 系統的檢測值比值多在 90%~110% 之間，表明兩套系統的檢測結果具有良好的一致性。低流速會影響濃縮樣品的混勻效果，因此取樣時樣品可能未混勻。FlowVPX 系統的檢測數據（圖 5）與濃度的預期變化趨勢一致：切向流過濾過程中蛋白濃度緩慢變化，加入緩沖液稀釋時蛋白濃度則急劇下降。

結論

05本研究表明，FlowVPX 系統可作為抗體藥物偶聯物工藝開發和生產制造中的實用工具：該系統可實現游離藥物清除的實時監控，在開發穩定的切向流過濾工藝時，能有效縮短整體工藝時間，降低成本。

FlowVPX 系統可對關鍵工藝參數進行實時監控，大幅縮短數據反饋和工藝驗證的時間，助力生產團隊及時做出科學的決策；在線檢測無需大量的離線分析操作，也簡化了穩定工藝向生產環境的轉移過程，同時還提升了滲濾過程中的料液體積控制精度。此外，該系統還能降低長時切向流過濾操作的監控復雜度，縮短工藝周期。

FlowVPX 系統可對切向流過濾過程中的藥物抗體比和單克隆抗體濃度進行持續監控，助力研究人員全面理解工藝過程；該系統對工藝條件的及時反饋，有助于快速排查工藝問題，實現超濾和滲濾工藝的有效優化。本研究中，研究人員通過 FlowVPX 系統監控藥物清除過程，確定了去除雜質分子的最佳滲濾體積倍數。在大規模生產中，持續的工藝監控能及時發現滲漏、膜污染等問題。

總體而言，在抗體藥物偶聯物生產中引入 FlowVPX 系統，可實現樣品的高效管理，降低操作和耗材成本，加快數據反饋和分析速度，同時對產品質量進行全程監控。