Femto ECL 是一款具有特超高靈敏度的增強型化學發光(ECL)底物，也是我們ECL發光液中的靈敏度非常好的化學發光底物，由于采用了核心技術基于“熒光震蕩"機理設計的發光底物系統。可通HRP實現實現低飛克級(以HRP濃度為準)的免疫印跡檢測，其靈敏度，發光時間和背景均明顯優秀。

其他所需材料

• 已完成轉印的印跡膜：用合適的電泳法分離蛋白質，并將這些蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上。

• 稀釋緩沖液：使用Tris或磷酸鹽緩沖液。

• 洗滌緩沖液：將5mL 10%的Tween-20加入1000mL稀釋緩沖液（Tween-20的終濃度將0.05%）。

• 封閉試劑：將0.5mL10%的Tween-20加入100mL的封閉緩沖液，選擇一種與稀釋緩沖液具有相同基本組分的封閉緩沖液。

• 一抗： 選擇一種目標蛋白質特異性抗體。使用稀釋緩沖液制備該抗體的儲存液。使用封閉試劑將抗體從儲備液稀釋成抗體工作液。最佳稀釋度取決于一抗和膜上的抗原量。

• HRP標記的二抗：選擇一種與二抗特異性結合的HRP標記二抗，使用稀釋緩沖液制備該抗體的儲存液。使用封閉試劑將抗體從儲備液稀釋成抗體工作液。稀釋度介于1:100000和1:500000之間或抗體工作液濃度為2～10ng/ml。該濃度范圍在使用鏈親和素-HRP時也適用。二抗的最佳稀釋度取決于HRP標記二抗和膜上的抗原量。

• 用于處理放射顯影膠片的膠片暗盒、顯影和定影試劑

• 用于孵育的旋轉搖床。

蛋白印跡法詳細操作步驟

1) 將印記膜從蛋白轉印設備中取出，加入合適的封閉液在溫室下孵育20-60分鐘，同時振蕩。以封閉膜上非特異性蛋白結合位點。請注意：使用在前文建議的抗體稀釋度是非常重要的。

2) 將膜從封閉液中取出，與一抗工作液在溫室孵育1小時，同時振蕩；或在28℃孵育過夜，不振蕩。

3) 將足量的洗滌緩沖液加至膜上，保證緩沖液將膜wan全覆蓋。振蕩孵育≥5分鐘，更換洗滌緩沖液并重復該步驟4-6次。增加洗滌緩沖液體積，洗滌次數和洗滌時間有助于降低背景信號。

注：孵育前，膜在洗滌緩沖液中的短暫淋洗會提高洗滌效率。

請注意：使用在前文建議的HRP標記二抗稀釋度是非常重要的。

4) 將HRP標記的二抗工作液與膜在溫室孵育1小時，同時振蕩。

5) 重復步驟3，以除去未結合的HRP標記二抗。注：膜與HRP標記二抗孵育后必須進行徹di洗滌。

6) 將A溶液與B液等比例混合，制備成工作液。每cm2膜使用0.01～0.1ml工作液。工作液可以在溫室下穩定8小時。注：暴漏雨日光或任何其他強光下可能損害工作液，為獲得最佳結果，將此工作液保存在琥珀色瓶中，并避免長期暴漏雨任何強光。實驗室的常見照明不會損害工作液。

7) 將印記膜在工作液中孵育5分鐘。

8) 從工作液中取出印記膜，并置于一個塑料片或清潔的塑料紙（膜）中，用一張吸水紙吸除多余的液體，并從印記和塑料紙之間小心地壓出氣泡。

9) 將包在塑料紙（膜）中的印記膜置于膠片暗盒中，蛋白質面朝上，除適用于膠片曝光的燈（如紅色安全燈）之外，關閉所有的燈。

注;膠片必須在曝光期間保持干燥，為獲得最佳效果，采取以下措施：

*   確保將多余的底物從膜和塑料紙上wan全去除。

*   在整個膠片處理期間，使用手套。

*   切莫將印記膜置于已顯影的膠片上，因為膠片上的化學物質會減弱信號。

10) 將X光膠片置于膜的上面。建議第一次曝光60秒。之后可調整曝光時間以達到最佳結果。化學發光反應在底物孵育后的前5-30分鐘期間是zui強烈的。這一反應可以持續幾個小時，但強度會隨時間下降，如有底物孵育后較長時間后曝光，曝光時間可能需要延長以獲得較強信號。如果使用磷光存儲成像設備（如Bio-Rad的分子成像儀系統）或CCD照相機可能需要較長的曝光時間。

   警告：膠片與膜之間的任何移動可能在膠片上造成人為的非特異信號。

11) 使用合適的顯影劑和定影劑對膠片進行顯影。如果信號太強，則縮短曝光時間或將印記膜進行剝離并降低抗體濃度重新檢測。