无码流出第一集2一亚洲无码,成人在线日韩中文字幕,欧美精品一二三四区中文字幕,国产中文字幕久久久久久,激情av五月天国产传媒,亚洲精品人妻在线视频,91成人精品免费在线观看视频,日韩色网站在线观看,99久久精品美女粉嫩奶头

摘要：目的探討大豆肽（soybean peptide, SP)通過下調Notch 1信號通路防治哮喘大鼠氣道炎癥反應的作用機制。方 法將60只SD雄性大鼠隨機分為正常對照組、哮喘模型組、地塞米松（Dexametha_Sone,Dex)0.5mg/kg組及大豆肽 600、300 及 150 mg/kg 劑量組。采用卵清蛋白（Ovalbumin, OVA) + 氨氣化f呂（Aluminum hydroxide, Al (OH) ₃)法復制大 鼠哮喘動物模型，同時給予相應劑量的大豆肽進行干預，每天給藥1次，連續7 d。末次給藥24 h后收集大鼠肺泡灌洗 ye（broncho - alveolar lavge fluid, BALF),進行白細胞分類計數；取大鼠右下葉肺組織常規HE染色，觀察肺組織病理學 改變及氣道重塑變化；采用逆轉錄PCR和Western - blot法檢測大鼠肺組織Notch 1、Jagged 1、Hes 1及NF - kB mRNA 和蛋白表達水平。結果與哮喘模型組比較，大豆肽600 mg/kg劑量組大鼠BALF中的中性粒細胞、淋巴細胞及嗜酸 性粒細胞計數顯著降低（P <0.01);大鼠肺組織病理損傷較模型組明顯改善，炎性細胞浸潤明顯減少；大鼠肺組織 Notch 1、agged 1、Hes 1及NF - kB mRNA和蛋白表達水平明顯下調（P <0. 05,P <0. 01)。結論大豆肽對哮喘大鼠 炎癥反應具有防治作用，其機制與下調Notch 1/Jagged 1/Hes 1/NF-kB信號通路有關。

關鍵詞：大豆肽；哮喘;Notch 1;炎癥

支氣管哮喘（bronchial asthma, BA)簡稱“哮喘” 是一種常見的呼吸系統炎癥性病癥，往往伴有巨噬細

作者簡介:張玲（1981 -),女，本科，講師，研究方向：呼吸系統疾病防治 通訊作者：徐松濤，E - mail:375874072@ qq. com 胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞、淋巴細胞及中性粒細胞 等炎性細胞浸潤和氣道上皮細胞損傷，出現氣道平滑 肌痙攣，表現為喘息、呼吸困難、氣急、劇烈咳嗽等哮 喘癥狀¹。Notch 1信號通路是調控細胞分化、遷移、 凋亡、增殖、炎癥及腫瘤發生等生理病理過程的重要 信號分子¹²。研究報道，Notch 1信號通路激活后可 誘導氣道成纖維細胞分化和增殖，促使氣管重塑，引
發免疫系統紊亂,誘導炎癥反應，從而引發和促進支 氣管哮喘的發生發展。大豆肽（soybean peptide, SP)是大豆經過酶解或微生物發酵分離提取得到的多 肽混合物，具有免疫調節、抗氧化、緩解疲勞等作 用。本研究觀察了大豆肽對哮喘大鼠的防治作 用，并以Notch 1信號通路為研究對象探討其抗炎平 喘分子機制。

1材料與方法

1.1實驗動物SD大鼠（SPF級），雄性,w齡，體 重180 ~200 g,湖南斯萊克景達實驗動物有限公司， 許可證號：SCXK (湘）2011 -0003。將大鼠適應性飼 養5d,每籠4 ~5只,3 ~4d更換1次墊料,調整室 內溫度為 22 ±2°C,濕度為 45% ~ 65%, 12 h/12 h 光照周期，常規飲食水。

1.2主要試劑大豆肽，河南省南街村（集團）有限 公司；地塞米松碟酸鈉注射液（Dexamethasone, Dex ) 國藥準字H41020055,鄭州卓峰制藥有限公司；卵清 蛋白（Ovalbumin, OVA),美國 Sigma 公司；兔抗 Notch 1、Jagged 1、Hes 1、NF - kB 及卩-actin 抗體，羊抗兔 辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP)標記二 抗、增強型RIPA蛋白裂解液、彩色預染蛋白Marker (10 ~180 KDa)、PVDF 膜及 SDS - PAGE 凝膠制備試 劑盒等均購自武漢博士德生物工程有限公司；Trizol 總 RNA 抽提試劑、Easy - Load™ PCR Master Mix (Blue, x)、BeyoRT™ II cDNA第yi鏈合成試劑盒等 由上海碧云天生物技術有限公司南通分公司提供； PCR實驗所需引物由南京金斯瑞生物科技有限公司 設計合成。

1.3實驗動物分組及處理將SD雄性大鼠隨機分為6組，每組10只，分別為：正常對照組、哮喘模型 組、地塞米松及大豆肽高、中、低劑量組。正常對照組 于實驗第1 d和第7 d腹腔注射生理鹽水0. 2 ml,其它 各組于實驗第1 d和第7 d腹腔注射致敏ye（OVA 5 mg +氯氧化鋁200 mg +生理鹽水1 ml充分混懸）0. 2 ml。第8 d,將大鼠置于誘咳引喘儀（XR - YLS -8A 多功能誘咳引喘儀，上海欣軟信息科技有限公司）中， 正常對照組大鼠用生理鹽水進行霧化激發，其它組用 1% OVA生理鹽水溶液進行霧化，1次/d,每次30 min。從霧化第2 d開始,于每次激發前正常對照組和 哮喘模型組灌胃生理鹽水，地塞米松組大鼠腹腔注射 地塞米松0. 5 mg/kg,大豆肽組大鼠分別灌胃大豆肽 600、00及150 mg/kg,連續激發和給藥7 d。末次激 發24 h后，將大鼠麻醉，快速取下肺組織，收集肺泡灌 洗液,進行白細胞分類計數，然后將肺組織用生理鹽 水沖洗干凈，取右下葉肺組織用于組織學檢測，剩余 組織凍存于-80C超低溫冰箱中備用。

1.4大鼠肺組織形態學觀察取大鼠右下葉肺組 織，置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h,經系列濃度乙 醇脫水后進行石蠟包埋、切片及HE染色，顯微鏡下 觀察肺組織病理學改變。

1.5 RT - PCR法檢測大鼠肺組織Notch 1、Jagged 1、 Hes 1及NF - kB mRNA表達水平取大鼠左上葉肺 組織約50 ~60 mg,置入盛有液氮的研缽中充分研磨 至粉末狀，加入1. 5 ml Trizol充分混勻裂解消化，12 000 rpm 4C離心20 min,吸取上清，根據試劑盒說明 書操作步驟進行RNA抽提和逆轉錄反應。將逆轉錄 得到的cDNA進行PCR擴增實驗，各待測基因引物序 列見表1。

1.6 Western blot 法檢測大鼠肺組織 Notch 1、Jagged 1、Hes1及NF - kB蛋白表達水平取大鼠左下葉肺 組織約80?100 mg,剪碎置于離心管中，加1.5 ml RIPA裂解液于冰上充分勻漿,然后再裂解約30min, 4C 12 000rpm離心15min,取上清移入1.5mlEP管 中，進行蛋白定量，并調整濃度一致。將上清樣品與 蛋白上樣緩沖液等體積混勻后煮沸5min,以25 ^l/

孔上樣，進行SDS-PAGE電泳，轉印至PVDF膜，依 次進行封閉、一抗、二抗孵育、顯色及拍照等步驟，以 p - actin 為內參,分析待測蛋白相對表達值。

1.7統計學處理用SPSS18.0統計軟件進行數據 處理,數據以Mean 盨D表示，多組間的兩兩比較采 用單因素方差分析（ one - way ANOVA)和 LSD - t 檢 驗，檢驗水準為a =0.05。

 

₂ # 中性粒細胞、淋巴細胞及嗜酸性粒細胞數明顯增多

(P<0.001);與哮喘模型組比較，大豆肽600、300 2.1大豆肽對哮喘大鼠BALF中白細胞分類計數的 mg/kg組大鼠BALF中中性粒細胞、淋巴細胞及嗜酸 影響與正常對照組比較，哮喘模型組大鼠BALF中 性粒細胞數顯著降低（P <0.001)。結果見表2。

組別	濃度（mg/kg)	中性粒細胞（107/L)	淋巴細胞（107/L)	嗜酸性粒細胞（107/L)
正常對照	-	8.04±1.36	19.53?.64	3.53?.45
哮喘模型	-	20.96 ?.53b	45.24 ?.47b	12.09?.69b
地塞米松	0. 5	9.71?.17d	23.72?.55d	4.43?.16ad
大豆肽高劑量	600	11.61?.07c	30.88 ?.89ac	5.61?.40bd
大豆肽中劑量	300	14.11?.47ac	35.98 ?.08bc	7.49?.63bc
大豆肽低劑量	150	18.46?.59b	43.62?.41b	10.49?.80b
F值		23.267	23.032	49.249
P值		<0.001	<0.001	<0.001

表2大豆肽對哮喘大鼠BALF中白細胞分類計數的影響（x 眘，= 10)

注：與正常對照組比較,P <0.05, ^bP <0.01;與哮喘模型組比較,P <0.05, ^dP <0.01

 

2.2大豆肽對哮喘大鼠肺組織病理學變化的影響 增厚，管腔變窄，部分有膠原沉積；大豆肽600、00

正常對照組大鼠肺組織結構完整，肺泡無萎縮塌陷， mg/kg組大鼠肺組織病理損傷較模型組明顯改善，炎

氣道內壁未見增厚，偶見炎性細胞浸潤；哮喘模型組 性細胞浸潤減少，肺泡結構較為完整，但仍不能恢復

&:正常對照組沁：哮喘模型組;〇:地塞米松組;3:大豆肽600瓜呂八呂;6:大豆肽300瓜呂八呂;£:大豆肽150瓜呂八呂大鼠肺組織可見多量、散在的炎性細胞浸潤，氣道壁 至正常。

圖1大豆肽對哮喘大鼠肺組織病理形態的影響（X200)

2.3大豆肽對哮喘大鼠肺組織Notch 1、Jagged 1、 Hes 1及NF - kB mRNA表達水平的影響與正常對 照組比較，哮喘模型組大鼠肺組織Notch 1、Jagged 1、 Hes 1及NF - kB mRNA表達水平明顯上調（P < 0.001);與哮喘模型組比較，大豆肽600 mg/kg組大

鼠肺組織 Notch 1、agged 1、Hes 1 及 NF - kB mRNA 表達水平顯者下調（P <0. 001)。結果見圖2、表3。 2.4大豆肽對哮喘大鼠肺組織Notch 1、Jagged 1、 Hes 1及NF - kB蛋白表達水平的影響與正常對照 組比較，哮喘模型組大鼠肺組織Notch 1、Jagged 1、

Hes 1及NF - kB蛋白表達水平明顯上調（P < 鼠肺組織Notch 1、Jagged 1、Hes 1及NF - kB蛋白表

表3大豆肽對哮喘大鼠肺組織Notch 1、Jagged 1、Hes 1及NF - kB mRNA表達水平的影響（x 土 s, n = 10)0.001);與哮喘模型組比較，大豆肽600 mg/kg組大 達水平顯著下調（P <0.001)。結果見圖3、表4。

組別	濃度（mg/kg)	Notch 1/ p - actin	Jagged 1/ p - actin	Hes 1/ p - actin	NF - kB / p - actin
正常對照	-	0.167?.029	0.249 ?.035	0.210?.039	0.116?.020
哮喘模型	-	0.458 ?.037b	0.669 ?.050b	0.435 ?.060b	0.805 ?.037b
大豆肽高劑量	600	0.317?.042ac	0.313?.039d	0.291?.018ac	0.564 ?.044bd
F值		47. 721	88.186	21.273	293.292
P值		<0.001	<0.001	0. 002	<0.001

注：與正常對照組比較,P <0.05, ^bP <0.01;與哮喘模型組比較,P <0.05, ^dP <0.01

 

 

表4大豆肽對哮喘大鼠肺組織Notch 1、Jagged 1、Hes 1及NF- kB蛋白表達水平的影響（x 土 s, n = 10)

組別	濃度（mg/kg)	Notch 1 /p - actin	Jagged 1 /p - actin	Hes 1 /p - actin	NF - kB / p - actin
正常對照	-	0.189 ?.040	0. 365 ?0. 043	0. 264 ?0. 027	0.258 ?.056
哮喘模型	-	0. 775 ?0. 042b	0.869 ?.047b	0.684 ?.046b	0. 908 ?0. 042b
大豆肽高劑量	600	0.552?.032bd	0.601?.030bd	0.551?.050bc	0.736 ?.058bc
F值		178. 316	115.681	78. 753	123. 500
P值		0. 000	0. 000	0. 000	0. 000

注：與正常對照組比較,P <0.05, ^bP <0.01;與哮喘模型組比較,P <0.05, ^dP <0.01

3討論

支氣管哮喘是多種炎性細胞浸潤或炎癥介質參 與的以氣道高反應性及重塑為特點，伴有氣管痙攣、 呼吸困難、咳嗽及喘息等癥狀的呼吸系統炎癥性疾 病^&]。在本研究中，與正常對照組比較，哮喘模型組 大鼠BALF中中性粒細胞、淋巴細胞及嗜酸性粒細胞 計數明顯增多，且HE病理切片觀察到氣管壁增厚， 管腔變窄，可見多量散在炎性細胞浸潤，以上結果與 哮喘的炎癥變化及病理學改變相一致，表明OVA致 哮喘大鼠模型成功建立。同時，與哮喘模型組比較,大豆肽600、00 mg/kg可減少哮喘大鼠BALF中中性 粒細胞、淋巴細胞及嗜酸性粒細胞數，且肺組織病理 學損傷得到明顯改善，提示大豆肽可減輕哮喘大鼠氣 道炎癥，改善肺組織病理性損傷，對哮喘有一定的防 治作用，但大豆肽防治哮喘的具體機制尚不明確。研 究表明，炎癥是導致哮喘患者或哮喘動物模型氣道增 殖、氣管重塑及肺組織損傷等病理變化的重要因素， 控制炎癥反應是緩解哮喘癥狀的重要措施⁸ ,為此本 研究以 Notch 1/Jagged 1/Hes 1/NF - kB 這^_炎癥信 號通路為研究靶點，探討大豆肽抗炎平喘分子機制。

哮喘的發生發展與炎癥細胞釋放炎性介質（如

IL-lp、IL-6及TNF-a等）激活Notch 1信號通路 密切相關⁹ — ^10]。Notch 1信號通路由其相應的配體 (Jagged 1)、受體（Notch 1)及上下游信號效應分子 (Hes 1、NF - kB)等組成，其調節異常可介導哮喘炎 癥的發生，參與氣道增殖、氣管重塑等病理過程^[11]。 在炎癥刺激作用下，Jagged 1與Notch 1相互結合， Notch 1 路即被激活，高表達 Notch

(notch intracellular domain, NICD)被釋放，其下游 Hes 1等關鍵靶基因被啟動，從而上調氣道上皮膠原蛋白 的表達，誘發氣道上皮下增殖和纖維化，引起哮喘氣 道重塑等病理性損傷^[12-13]。NF - kB是Notch 1信號 通路調控巨噬細胞介導的炎癥反應主要靶分子之一， Notch 1通路活化后，激活I - kB激酶（I - kB kinase, IKK), IKK作用于I - kB使其發生磷酸化，使得NF - kB/ I - kB二聚體復合物解離,NF - kB發生磷酸化 并通過核膜轉移進入核內，與DNA特異性結合位點 相互作用，快速啟動IL - 6、IL - 5及TNF - a等靶基 因的轉錄,生成相應的炎癥因子，促使炎癥反應的發 生^[14]。同時,生成的炎癥因子又是Notch 1和NF - kB 的活化劑，進一步激活 Notch 1/Jagged 1/Hes 1/NF -kB信號通路，如此周而復始使炎癥反應持續放大 和擴散，使哮喘癥狀不斷加重，誘發氣道內皮細胞增 殖和氣管重塑等病理性損傷^[15]。本研究發現，大豆 肽600 mg/kg可使哮喘大鼠肺組織Notch 1、Jagged 1、 Hes 1及NF - kB mRNA和蛋白表達水平明顯下降， 提示其抗炎平喘機制與下調Notch 1/Jagged 1/Hes 1/ NF-kB信號通路有關。