AF532 NHS（包括AF532 NHS ester、AF532 SE、AF532琥珀酰亞胺酯，CAS號：477876-64-5）是一種集綠色至黃綠色熒光信號輸出與氨基偶聯功能于一體的多功能熒光標記試劑。

一、化學本質與結構

分子式與分子量：C??H??N?O??S?，分子量約為723.77 g/mol。

結構組成：由Alexa Fluor 532熒光核心與N-羥基琥珀酰亞胺酯（NHS Ester）官能團結合而成。熒光核心提供穩定熒光信號，NHS酯官能團實現與氨基的高效共價結合。

外觀與純度：通常為深紅色或紅色固體粉末，純度≥95%（部分產品可達98%）。

二、光學與熒光特性

激發與發射波長：激發波長為524 nm，發射波長為547 nm，呈現綠色至黃綠色熒光。

熒光性能：

具有高亮度熒光輸出，量子產率高，光穩定性強，適合高靈敏度成像和定量分析。

發射波段可與紅色或近紅外染料組合，實現多色實驗體系構建。

儀器兼容性：許多流式細胞儀配備532 nm激光，AF532 NHS可用于流式細胞術；同時，其熒光特性也適用于熒光顯微鏡等成像設備。

三、反應特性

1.反應基團：NHS酯官能團可與蛋白質、肽鏈或其他含自由氨基的分子（如賴氨酸殘基或蛋白質N端）在溫和條件下形成穩定的酰胺鍵。

2.反應條件：

通常在干燥有機溶劑（如DMSO或DMF）中溶解，反應在0.1-0.2 M碳酸氫鈉緩沖液（pH 8.3）中進行，室溫下反應1小時。

反應條件溫和，不破壞蛋白質結構，適合敏感生物分子及多步修飾實驗。

偶聯效率：熒光核心與NHS酯末端通過柔性連接子隔開，降低空間阻礙，提高偶聯效率和熒光信號完整性。

四、應用場景

1.生物標記：

廣泛用于蛋白質、多肽及抗體的氨基官能化修飾，通過酰胺化反應形成穩定共價鍵，實現綠色熒光標記。

標記的蛋白質可用于膜蛋白、胞內靶分子或細胞外基質的熒光成像。

2.免疫分析：

用于標記抗體或抗原，檢測樣本中特定蛋白質的表達水平，幫助研究人員了解免疫反應機制和相關蛋白的變化。

3.流式細胞術：

憑借強熒光信號和高量子產率，對細胞進行熒光標記，通過流式細胞儀分析細胞的各種特性，如細胞表面標志物的表達、細胞周期等。

4.細胞成像：

標記細胞內的特定蛋白質或細胞器，如標記細胞膜用于觀察細胞膜的動態變化，標記細胞核用于研究細胞核的結構和功能等。

5.核酸標記：

與胺修飾的寡核苷酸（如5'-氨基接頭C6-NH?）進行偶聯，用于FISH探針、實時PCR標記等。

6.材料功能化：

用于納米顆粒或聚合物表面功能化，通過氨基偶聯形成穩定熒光修飾，便于多功能復合體系和材料體系的開發。

五、儲存條件

溫度：需在-20℃以下冰凍保存，以保持熒光活性及化學反應能力。

避光：儲存和操作過程中需避光，防止熒光淬滅。

干燥：保持干燥環境，避免NHS酯官能團水解失效。

六、操作注意事項

干燥操作：取用時一定要干燥，避免頻繁的溶解和凍干，防止NHS酯水解。

現配現用：溶解后應盡快使用，避免長時間放置導致熒光性能下降。

溶劑選擇：通常溶解于高質量的無水DMF或DMSO中，反應體系需保持干燥。

pH控制：反應pH值通常在8.3左右，可根據實驗需求調整，以實現更選擇性的氨基末端標記。

七、相關試劑

AF430 amine

Alexa Fluor 430 NH2

AF430 azide

Alexa Fluor 430 N3

AF568 alkyne (5-isomer)

AF430 carboxylic acid

Alexa Fluor 430 COOH

AF488 azide

Alexa Fluor 488 N3

AF488 carboxylic acid

Alexa Fluor 488 COOH

AF594 amine

Alexa Fluor 594 NH2

AF514 NHS ester

Alexa Fluor 514 SE

AF546 NHS ester

Alexa Fluor 546 SE

AF555 NHS ester

Alexa Fluor 555 SE

AF750 NHS ester

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