iPSC分化多巴胺能神經元完整方案  

一、前言（原文資料可聯系上海曼博生物獲取）

利用誘導多能干細胞（iPSCs）生成多巴胺能神經元的能力，在科研和治療領域都具有較大潛力。iPSC衍生的多巴胺能神經元為研究帕金森病等神經退行性疾病以及精神分裂癥等精神疾病中多巴胺信號傳導失調的機制提供了一個寶貴的模型。隨著研究的深入，這些發現有望轉化為臨床應用，從而對患者護理和疾病管理產生變革性的影響。

將誘導多能干細胞（iPSCs）分化為多巴胺能神經元需要特定的條件才能獲得所需的細胞類型。本應用說明將介紹我們使用多種培養基，并在關鍵分化步驟的不同階段添加一系列Qkine生長因子和細胞因子補充劑（Qkine有多巴胺能神經元分化套裝，Qk517），從而將人iPSCs分化為功能性多巴胺能神經元的方法。

二、介紹

多巴胺能神經元是負責合成、儲存和釋放神經遞質多巴胺的特殊神經細胞。這些神經元在多種重要的腦功能中發揮著關鍵作用，包括運動控制、獎賞、動機和情緒調節[1]。多巴胺能神經元主要位于大腦的黑質和腹側被蓋區。它們投射到包括紋狀體、前額葉皮層和邊緣系統在內的多個腦區，形成復雜的神經網絡，影響著多種行為和生理過程[2]。

多巴胺能神經元對運動控制十分重要，帕金森病中多巴胺能神經元的退化便證明了這一點。帕金森病是一種以震顫、僵硬和運動遲緩等運動癥狀為特征的疾病。在精神疾病中，多巴胺能信號傳導失調也與疾病密切相關。例如，多巴胺能通路過度活躍與精神分裂癥的陽性癥狀相關，而多巴胺功能減弱則與抑郁癥中的快感缺失和動力不足有關[2]。將誘導多能干細胞（iPSCs）分化為多巴胺能神經元是具有重要意義的研究領域，有望用于治療神經系統疾病，尤其是帕金森病。

三、方法

1、細胞培養與維護

將人誘導多能干細胞 (iPSCs) 培養于E8樣培養基中，置于預先包被玻連蛋白Qk120 (5 µg/ml) 的6孔板中，并采用Qkine周末免換液的培養方式。每3-4天使用0.5 µM EDTA進行傳代，并以1:6的比例進行分樣，以確保在開始分化過程前獲得高質量的iPSCs。

2、誘導多能干細胞分化為中腦特異性底板祖細胞

當iPSCs達到所需的匯合度和質量后，使用Accutase進行傳代，并以3.8× 10?個細胞/毫升的密度接種到 Geltrex 包被的 24 孔板中。然后讓它們貼壁，直到達到 90-100% 的匯合度，形成單層細胞。

3、神經誘導和多巴胺能特化

首先使用SB431542通過雙重SMAD抑制將iPSCs引導至神經祖細胞 (NPCs)，SB431542可抑制維持多能性的通路，并利用成纖維細胞生長因子8 (FGF-8a，Qk059) 等關鍵分子促進神經分化，從而發育為多巴胺能神經元，而FGF-8對中腦多巴胺能神經元的特化很重要。

4、成熟與維持

最后階段涉及這些細胞成熟為功能性多巴胺能神經元（圖1），這可以通過腦源性神經營養因子（BDNF，Qk050）、膠質細胞系衍生神經營養因子（GDNF，Qk051）和轉化生長因子β3（TGF-β3，Qk054）等因子來支持。

圖1. 第20天，中腦定向的底板祖細胞正在分化形成底板球狀體，圖示為球狀體分離傳代前的成熟階段（比例尺=300 µm）。

第1天：使用Induction Media 1更換培養液。

第2-3天：使用Induction Media 2更換培養液。

第4-5天：使用Induction Media 3更換培養液。

第6-7天：使用Induction Media 4更換培養液。

第8-9天：使用Induction Media 5更換培養液。

第10-11天：使用Induction Media 6更換培養液。

第12-13天：使用Induction Media 7更換培養液。

第14-19天：使用Maturation Media更換培養液。

第20天：底板球狀體的分離與傳代

細胞使用Accutase和Papain的組合進行傳代以將其分離，然后用含有DNase I的DMEM/F-12培養基進行洗滌和過濾。之后，再次僅用DMEM/F-12進行洗滌和過濾。最后，細胞以8.645 x 10^5個細胞/毫升的密度接種到涂有Geltrex的24孔板中，并加入Seeding Media。

第21–30天、第32天和第34天：使用Maturation Media更換培養液

培養基按第14–19天所制備的方法配制。

四、結果

在第35天，可以觀察到成熟的多巴胺能神經元（圖2）。

圖2. 第35天分化成熟的多巴胺能神經元（左：比例尺=750 µM；右：比例尺=300 µM）。

五、結論

將誘導多能干細胞分化為多巴胺能神經元是推進再生醫學和神經科學發展的重要工具。可靠地獲得持續的高質量結果，有助于我們深入了解調控神經發育和退化的基本過程，并為帕金森病等神經退行性疾病的創新療法研發奠定基礎。

本應用說明中提供的數據表明，使用 Qkine無動物來源的生長因子FGF-8a（Qk059）、BDNF（Qk050）、GDNF（Qk051）和 TGF-β3（Qk054）可以支持iPSCs在35天內分化為成熟的多巴胺能神經元。

更多信息

Qkine生長因子按照高質量標準生產，不含動物源性污染物，具有低內毒性和高純度。Qkine致力于提高生長因子、細胞因子和相關蛋白的標準，以更好地支持長期復雜的細胞培養。

上海曼博生物醫藥科技有限公司是Qkine正式授權的中國提供商，如有細胞因子相關疑問或需求，請聯系我們。

參考文獻

[1] O Klein, M. et al. Dopamine: Functions, Signaling, and Association with Neurological Diseases. Cellular and Molecular Neurobiology. 2019 Jan;39(1):31-59. doi: 10.1007/s10571-018-0632-3

[2] Zhuang, Y. et al. Mechanism of dopamine binding and allosteric modulation of the human D1 dopamine receptor. Cell Research 2021 May;31(5):593-596. doi.org/10.1038/s41422-021-00482-0