Small重磅研究｜PBS-Mini反應器3D培養體系賦能MSC-EVs角膜神經再生

本文摘要

本文基于《Small》期刊發表的角膜神經再生前沿研究，系統解析了間充質干細胞來源細胞外囊泡（MSC-EVs）的制備關鍵參數，對比了2D常規培養與3D生物反應器培養體系對EVs產量、分子特征及角膜神經再生效能的影響，明確了組織來源與培養維度對EVs治療效果的調控作用，為眼科再生醫學領域的無細胞治療研發提供了嚴謹的試驗參考與數據支撐。

一、研究背景：角膜神經再生的臨床困境與MSC-EVs的治療潛力

角膜是人體神經支配很密集的組織，其感覺神經易受外傷、手術、疾病等因素損傷，而損傷后神經再生進程緩慢，易引發角膜感覺減退、持續性上皮缺損、神經性疼痛等并發癥，現有單因子治療方案難以實現理想的解剖與功能恢復。

間充質干細胞（MSCs）來源的細胞外囊泡（EVs）作為新型無細胞治療方案，是再生醫學領域的研究熱點。其可通過攜帶的蛋白、脂質、RNA等生物活性物質介導細胞間通訊，發揮抗炎、促再生等作用，為角膜神經損傷修復提供了新的解決思路。

本研究聚焦角膜來源MSCs（Co-MSCs）與骨髓來源MSCs（BM-MSCs）兩大細胞來源，系統探究組織來源與培養維度對EVs角膜神經再生效能的影響，為EVs療法的工藝優化與臨床轉化提供核心試驗依據。

作為PBS Biotech、RoosterBio和Izon Science的中國直售提供商和合作伙伴，在外泌體研究領域，曼博生物可提供從上游細胞培養、EVs規模化制備，到下游分離純化與表征的全流程物料與設備解決方案，包括本研究用到的RoosterBio專用培養基（曼博生物中國直售RoosterBio，可咨詢曼博生物）、PBS垂直輪生物反應器（曼博生物中國直售PBS，可咨詢曼博生物），助力國內外泌體相關研究與產業化落地。

二、研究設計：MSC-EVs制備與功能驗證的全流程試驗方案

Part1-該研究圍繞MSC培養、EVs分離表征及功能驗證展開了系統性試驗設計，各環節關鍵參數與操作流程均明確量化，具體如下：

2.1  細胞來源與基礎培養

選取5名不同供體的Co-MSCs與BM-MSCs，細胞均使用至第3-5代，保障實驗用細胞的活性與均一性。細胞培養至80%-90%匯合度后，用于后續2D、3D培養體系的接種。

2.2  2D與3D培養體系構建

2.2.1   2D常規培養體系

采用T225培養瓶，以13000 cells/cm2的密度接種，培養至80%匯合度后，更換無血清培養基誘導EVs分泌，72小時后收集細胞分泌組（secretome），用于后續EVs分離。

2.2.2  3D生物反應器培養體系

基于PBS垂直輪式生物反應器開展3D培養，核心操作流程如下：

1) PBS Mini 0.1L反應器內加入1.25g預孵育的低濃度SynthemaxII微載體，接種2×10?個細胞，搭配90mL生長培養基（RoosterBasal MSC-CC培養基+2%的RoosterBooster-MSC-XF）；

2) 先靜置培養30分鐘（20分鐘后輕搖重懸未貼壁細胞，再靜置10分鐘），隨后以25 rpm轉速培養73小時；

3) 第3天取樣計數細胞，并補加專用補充劑（RoosterBooster-MSC-XF），將轉速調整至35 rpm繼續培養；

4) 第5天更換無血清外泌體收集培養基（phenol red-free RoosterCollect-EV media），培養72小時后收集分泌組，經100μm細胞篩去除微載體后備用。

圖1. MSC-EVs角膜神經再生研究實驗流程示意圖。

a）2D/3D體系擴增角膜/骨髓來源MSCs，完成EVs提取與多維度表征；

b）體外驗證EVs對TgV1神經元神經突生長的促進作用；

c）體內驗證EVs在角膜損傷模型中的神經再生修復效能。

2.3  EVs的分離與全面表征

兩組培養體系的分泌組均先經梯度離心預處理，500×g離心15分鐘去除細胞，2000×g離心10分鐘去除細胞碎片；隨后分別采用超速離心法和商業化沉淀試劑盒兩種方法分離EVs，為保證EVs完整性，后續實驗選用商業化試劑盒分離的產物。

表征環節通過多維度檢測完成，核心檢測項目包括：

•   納米顆粒跟蹤分析（NTA）檢測EVs的顆粒濃度與尺寸分布；

•   ExoView分析CD9、CD81、CD63等四跨膜蛋白表達特征；

•   蛋白質印跡法（Westernblot）驗證外泌體標志物ALIX、細胞污染標志物Calnexin等蛋白表達，確認EVs純度；

•   透射電子顯微鏡（TEM）：觀察EVs的形態特征。

2.4  EVs神經再生功能驗證

2.4.1  體外功能驗證

分離4-6周齡小鼠三叉神經節神經元（TgV1），接種于多聚賴氨酸包被的培養皿，待出現初始神經突生長后，加入不同組別EVs（終濃度2×10?個/培養皿），培養48小時后，通過βIIItubulin免疫熒光染色，結合Neurolucida軟件定量分析神經突長度，并通過GAP-43染色檢測神經再生芽生情況。

2.4.2  體內功能驗證

構建10-12周齡小鼠2mm角膜上皮清創損傷模型，對損傷眼結膜下注射5μL EVs（含2×10?個顆粒），設置空白培養基組為對照；術后14天解剖小鼠角膜，經免疫熒光染色后，量化角膜中心1mm區域的神經長度；同時采用vonFrey細絲檢測角膜眨眼閾值，評估角膜感覺神經的功能恢復情況。

2.5  分子機制探究

對不同培養體系、不同組織來源的EVs進行小RNA測序，分析其miRNA表達譜，篩選差異表達miRNA；通過RT-qPCR驗證關鍵miRNA的表達水平，并結合靶基因預測與通路富集分析，探究EVs調控角膜神經再生的分子機制；同時檢測TgV1神經元中神經再生相關基因的表達，驗證通路調控作用。

三、核心結果：3D培養體系對MSC-EVs產量與再生效能的關鍵影響

Part2-該研究通過多維度檢測，客觀呈現了PBS反應器3D培養體系在MSC-EVs制備中的表現與優勢，核心試驗結果均以定量數據呈現，具體如下：

3.1  3D培養提升MSC-EVs的產量與優質顆粒占比

NTA檢測結果顯示，3D培養體系的EVs顆粒濃度明顯高于2D培養，核心數據如下：

•  3D-BM-MSC-EVs顆粒濃度：(1.03±2.72)×1011個/mL

•  3D-Co-MSC-EVs顆粒濃度：(8.64±1.96)×101?個/mL

•   2D-BM-MSC-EVs顆粒濃度：(5.37±1.35)×10?個/mL

•   2D-Co-MSC-EVs顆粒濃度：(1.41±1.32)×101?個/mL

兩組數據差異具有統計學意義（p<0.05）。

粒徑分布分析顯示，所有組別EVs中80%以上顆粒直徑小于200nm，符合外泌體典型尺寸范圍；其中3D培養組的小尺寸顆粒占比更高，3D-BM-MSC-EVs為88.3%±4% ，3D-Co-MSC-EVs為91.0%±2%。

圖2. MSC-EVs的分離方法對比與多維度表征結果。

a）分離方法對比：超速離心法（UC）獲得的EVs產量更高，但與商業化沉淀試劑盒相比，差異無統計學意義；

b）小尺寸EVs富集效果：商業化試劑盒分離的<200nm小尺寸EV占比更高，其中角膜來源EVs（CoEVs）組差異具有統計學意義，骨髓來源EVs（BMEVs）組無明顯差異；

c）培養維度對產量的影響：納米顆粒跟蹤分析（NTA）顯示，3D培養來源EVs的顆粒濃度高于2D培養組（p<0.05），證實3D培養可提高EVs產量；

d）粒徑分布特征：四個EVs實驗組中，超80%的顆粒直徑小于200nm，符合外泌體的典型尺寸范圍；

e）FTLA分析：所有EVs樣本的濃度/粒徑分布趨勢一致，峰值均低于200nm；

f）各組間單位細胞產生的EVs數量無明顯差異，實驗分組間具備可比性；

g）EVs純度驗證：Western blot結果顯示，EVs組分富集外泌體標志物ALIX，未檢出細胞污染標志物Calnexin與GAPDH，而母細胞裂解液中可檢出上述三種蛋白，證實EVs純度達標；

h）NTA可視化結果：3D培養來源EVs的顆粒濃度高于2D組，空白收集培養基（CM）中僅檢出少量顆粒；

i）形態學驗證：所有EVs組的透射電子顯微鏡（TEM）圖像證實，存在具有外泌體典型杯狀和球形形態的納米顆粒。

注：圖中誤差線代表標準誤（SE）；星號表示差異具有統計學意義；每組設3個生物學重復；比例尺=200nm。

3.2  3D來源EVs體外促神經再生效果優于2D組

體外實驗結果證實，3D培養體系來源的EVs促進TgV1神經元神經突生長的效果更明顯

3D-Co-MSC-EVs處理組神經突長度為12.64±1.5mm，3D-BM-MSC-EVs處理組為10.21±1.24mm，均明顯高于對應的2D培養組（2D-Co-MSC-EVs組5.3±0.58mm、2D-BM-MSC-EVs組3.0±0.32mm），且p<0.05；同時3D-EVs處理組的GAP-43陽性信號更強，神經再生芽生更活躍。

圖3. MSC-EVs對三叉神經節神經元神經突生長的體外功能驗證。

a）明場圖像展示了處理前（培養至第2天）的神經突生長狀態；

b）處理48小時后的20倍明場圖像顯示，3D培養來源EVs處理組的神經元神經突生長，優于2D培養來源EVs處理組及各對照組；

c）β-Ⅲ微管蛋白熒光成像進一步證實，3DEV處理組的神經生長情況優于2DEV組與空白對照組；

d-f）Neurolucida定量分析結果顯示，無論是角膜來源（CoEVs）還是骨髓來源（BMEVs）的EVs，3DEV處理組的神經突伸長量均高于對應的2DEV處理組；

g）GAP-43免疫熒光成像顯示，3DEV處理組的神經再生相關信號強于2DEV處理組與空白培養基（CM）對照組。

3.3  3D來源EVs體內角膜神經修復與功能恢復效果更突出

術后14天，3D-EVs處理組小鼠角膜神經再生與功能恢復均優于2D組及空白對照組，3D-Co-MSC-EVs組角膜神經長度為51.9±9.1mm，3D-BM-MSC-EVs組為42.2±3.5mm，高于對照組的23.3±1.2mm（p<0.01）；角膜敏感性檢測中，3D-EVs處理組的眨眼閾值明顯低于對照組，表明感覺神經功能恢復更理想。

圖4. MSC-EVs在小鼠角膜損傷模型中的體內神經再生與功能恢復效果驗證，角膜清創及治療注射后2周，通過βIIITubulin抗體染色結合Neurolucida分析評估神經再生情況

a）對角膜中央1mm區域的神經纖維密度進行定量分析；（a插圖）小圖為再生神經的代表性追蹤結果，采用NeurolucidaExplorer軟件進行彩色標記和測量。

b）與2DCoEV）處理組及對照組相比，3DCoEVs處理組的角膜神經生長增加，差異具有統計學意義。

c）與2DBMEVs處理組及對照組相比，3DBMEVs處理組的角膜神經生長明顯增加，差異具有統計學意義。

d）CoEVs處理組的角膜神經再生效果略優于BMEVs處理組，但差異無統計學意義。

e）采用馮?弗雷細絲（vonFreyhairfilaments）評估角膜神經功能：眨眼閾值越高表明敏感性越低；對照組角膜的眨眼閾值高，而3DCoEVs處理組的角膜敏感性好；所有EVs處理組的角膜敏感性均優于對照組。采用雙尾獨立樣本t檢驗評估不同處理對損傷角膜神經再生的統計學影響；比例尺=1000μm；每組條件設4個生物學重復；CM代表未處理收集培養基。

3.4  培養維度改變EVs的miRNA表達譜

小RNA測序顯示，3D培養明顯改變了EVs的miRNA表達譜，3D-BM-MSC-EVs中hsa-miR-128-3p、hsa-miR-409-3p等神經營養相關miRNA高表達，3D-Co-MSC-EVs中則富集調控細胞外基質重塑的miRNA；且3D培養降低了不同組織來源EVs的miRNA表達異質性。RT-qPCR驗證顯示，3D-EVs處理能明顯上調TgV1神經元中神經突生長、突觸形成及基質重塑相關基因的表達。

圖5. 不同組織來源及培養條件下MSC-EVs的miRNA表達譜特征。

a）柱狀圖顯示2D和3D培養的BM-MSC及Co-MSC來源EVs中，共有的20種高豐度表達miRNA。

b）2D CoEVs與2D BMEVs的對比分析顯示，差異表達的miRNA數量多，表明二維培養條件下不同組織來源EVs的分子差異明顯。

c）3D CoEVs與3D BMEVs的對比分析顯示，差異表達miRNA數量大幅減少，表明三維培養條件下不同組織來源EVs的分子相似性更高。

d）3D BMEVs與2D BMEVs的對比分析顯示，部分miRNA明顯上調，表明培養維度對BMEVs的內容物組成影響突出。

e）相反，3D CoEVs與2D CoEVs的對比分析僅發現1種miRNA（hsa-miR-159）表達明顯改變，表明角膜間充質干細胞來源EVs的內容物組成在不同培養維度下相對穩定。

f）miRNA表達熱圖顯示，樣本按培養條件呈明顯聚類，且3D培養組的組織特異性差異較2D培養組有所降低。

四、研究價值與產業轉化意義

本研究通過嚴謹的試驗設計，系統證實了PBS垂直輪式生物反應器的3D培養體系在MSC-EVs制備中的核心應用價值：其低剪切力的流體動力學設計構建的仿生微環境，既保證了細胞活性，又優化了EVs的產量與功能；同時明確了組織來源對EVs治療效能的影響，為角膜神經再生的EVs療法優化提供了直接的試驗依據。值得注意的是，研究中細胞擴增與EVs收集全程采用RoosterBio專用培養基，其化學成分限定的無血清配方，為試驗結果的可靠性與后續臨床轉化提供了保障。

曼博生物作為PBS Biotech、RoosterBio和IZON Science的中國直售和提供商，致力于將這類經過科研驗證的優質生物工藝解決方案引入國內，為再生醫學、細胞治療領域的研究與產業化提供有力支持。

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