哈佛資訊

點擊下圖查看哈佛資訊??

英國Nuclera公司的eProtein Discovery是一個無細胞蛋白質合成（CFPS）系統，也被稱作體外轉錄/翻譯系統，能夠實現蛋白質的快速原型設計。該系統采用數字微流控芯片和定制試劑，可針對多達192種條件篩選蛋白質表達與可溶性，包括在8種無細胞表達條件下對至多24種構建體的篩選。可在48小時內完成從DNA到蛋白質篩選與放大生產。

可掃描下方圖片訪問曼博生物網站查看具體無細胞蛋白表達系統產品信息

使用eProtein Discovery系統快速無細胞表達和純化B淋巴細胞抗原CD19

一、引言

B 淋巴細胞抗原CD19是一種跨膜糖蛋白，為B細胞惡性腫瘤生物標志物、CAR - T等療法理想靶點，包含單個跨膜螺旋（292-313）、天然信號肽（1-20）、胞外N端結構域（ECD）和胞內C端結構域（ICD）。其ECD有兩個通過二硫鍵連接的免疫球蛋白樣C2型結構域，ICD有多個無序區域。生產CD19，尤其是ECD對開發新的B細胞淋巴瘤治療方法十分重要。然而，ECD素來有“難表達"的特點，會導致表達滴度低、蛋白質錯誤折疊和聚集，阻礙了對細胞表面分子的詳細分子研究。

在本應用中，我們利用eProtein Discovery系統的可溶性標簽選擇功能和無細胞混合物，在24小時內篩選了192種表達條件，優化了可溶性CD19蛋白的生產（如圖1所示）。我們成功表達并純化了全長CD19、ECD和ICD。篩選完成后，在24小時內將適合條件進行放大，可生產微克級的蛋白質，從而實現了治療研究所需復雜蛋白質的提效生產。本應用為表達其他具有跨膜結構域、二硫鍵和高度無序區域的“難表達"蛋白質提供了參考。

二、eProtein Discovery工作流程

eProtein Discovery系統利用無細胞蛋白質合成技術，可快速篩選蛋白質構建體并放大生產復雜蛋白質（圖1）。

圖1. eProtein Discovery工作流程。從DNA到可溶性蛋白只需48小時。

在本研究中，選擇了三種CD19長度變體：全長CD19（CD19_21-556）、N端截短體（CD19_21-277）和C端截短體（CD19_327-556）。這兩種截短體均去除了CD19的跨膜區域。此外，全長和N端截短體均省略了初始信號肽序列（0-20）。這些變體被輸入eProtein Discovery軟件并進行密碼子優化，隨后添加3C和TEV側翼序列。使用可溶性篩選構建體試劑盒生成包含不同可溶性標簽的表達構建體，以及一個不含可溶性標簽的構建體。每個構建體的C端均整合了用于磁珠純化的Strep標簽和用于表達純化后蛋白質定量的檢測標簽（圖2A）。

圖2. 實驗篩選條件。（A）為三種CD19長度變體生成的帶有可溶性標簽的 eGene 構建體。

在制備eGene構建體后，向8種包含無細胞核心試劑的無細胞混合物中添加各種添加劑，包括分子伴侶（DnaK）、二硫鍵促進劑（PDI+/GSSG）和可溶性標簽切割酶（3C蛋白酶）（圖2B）。

圖2. 實驗篩選條件。（B）用于提高可溶性蛋白產量的無細胞混合物選擇。

將24種eGene構建體和8種無細胞混合物與純化磁珠、對照/空白樣品和緩沖液一起加樣到卡盒上。這種利用eProtein Discovery系統的設置，促進了192種表達譜的自動生成和分析。每種CD19變體表達最高的10種eGene/無細胞混合物組合會被自動選擇用于純化，并完成蛋白質檢測以確定預測的放大產量，所有這些都在24小時內完成。

對于每種CD19變體，將預測產量至高的表達方案第二天進行放大生產，并使用放大試劑盒進行純化，以生產微克級的蛋白質。蛋白質純度和產量通過SDS-PAGE和熒光測定法進行定量分析。

三、結果

eProtein Discovery系統成功表達并純化了全長CD19蛋白及其截短變體，證明了其*的性能（見圖 3）。該系統用于快速篩選192種表達條件，并在24小時內獲得30個可純化性數據點，以確定生產可溶性CD19蛋白變體的最佳條件（圖 3A 和 3B）。

圖3. 篩選結果。（A）每種eGene構建體與無細胞混合物組合的表達產量。

圖3. 篩選結果。（B）每種CD19長度變體表達量至高的 10 種組合經純化后確定純化濃度。

在三種CD19變體中，N端胞外結構域（CD19_21-277）的蛋白產量更高，預測產量達29.68 μg/200 μL（圖 3C）。

圖3. 篩選結果。（C）200μL放大體系的預測產量。

引入可溶性標簽（尤其FH8標簽）使CD19總產量顯著提升32% ；無細胞混合物中添加PDI+/GSSG可促進二硫鍵形成，提升ECD表達量，混合物4與FH8標簽聯用預測產量更高，混合物3則兼具高產量與標簽切除靈活性。該系統成功篩選出生產可溶性全長CD19的條件，產量4.29 μg/200 μL，混合物3表現優，體現優化蛋白生產的多功能性與精準性，不過全長CD19產量仍需優化。無細胞系統有效降低了天然系統中無序蛋白常見的蛋白酶降解風險，同時通過可溶性標簽和添加劑的使用減少不溶性聚集物的產生。這一能力使得該挑戰性蛋白得以成功表達和純化。

在篩選192種表達條件并純化30種以確定預測產量后，每種CD19變體的合適條件被放大，在24小時內生產出微克級蛋白用于下游應用。SDS-PAGE分析證實所有CD19變體均成功表達，其中N端ECD純度達88%，C端胞內結構域純度達100%，但全長蛋白純度較低（圖4A）。通過內部熒光測定和SDS-PAGE進行的蛋白產量定量與預測產量高度吻合，證明了該系統從篩選到放大的可靠性（圖4B）。總體結果證實了eProtein Discovery系統在明顯加速高質量復雜蛋白生產方面的有效性和精確性。

圖4. CD19放大生產結果。（A）使用優化后的eGene/無細胞混合物在200 µL體系中表達并純化的CD19長度變體的SDS-PAGE分析（FT=流出液）。

圖4. CD19放大生產結果。（B）通過內部熒光測定和SDS-PAGE確定的蛋白產量與系統預測產量的對比。

四、結論

通過同步測試不同CD19蛋白構建序列、可溶性標簽及蛋白表達參數，eProtein Discovery可在24小時內快速確定合適的蛋白表達條件，并在48小時內獲得目標蛋白。這一能力使研究人員能夠快速開展蛋白靶點鑒定及疾病機制相關蛋白的驗證工作。該系統整合數字微流控技術、蛋白質質量分析及無細胞蛋白合成技術，即使對于最難表達的蛋白質也能實現快速制備，從而大幅簡化了治療性研究與開發的流程。

KEY英國Nuclera公司由劍橋大學的博士生們于2013年創立。在撰寫論文期間，他們發現蛋白質難以獲取的問題是生物學領域的重要障礙和瓶頸。他們著手解決蛋白質難以獲取的問題，以期改善人類健康狀況。公司的愿景是打造出從DNA到蛋白質的原型設計系統，以減少在藥物發現計劃中獲得靶蛋白的時間和障礙。

上海曼博生物是Nuclera品牌eProtein Discovery 無細胞蛋白表達系統中國直售提供商。如咨詢產品信息，歡迎掃碼添加小助手微信聯系我們！