案例1：鋅離子（Zn2?）是活性金屬蛋白酶表達的必需條件金屬離子

嗜熱菌蛋白酶是一種熱穩定的鋅金屬蛋白酶，由嗜熱蛋白分解芽孢桿菌分泌產生。該酶的應用場景較多：可用于人工甜味劑阿斯巴甜的生產，在肽圖分析中用作非特異性蛋白酶，同時也是抗高血壓藥物研發過程中的重要作用機制模型。鋅離子是嗜熱菌蛋白酶發揮催化活性的必需物質，此外該酶還能結合四個鈣離子，這些鈣離子被認為有助于增強其熱穩定性。

研究人員使用Nuclera的eGene制備試劑盒構建了線性、無標簽的嗜熱菌蛋白酶表達構建體，并結合Nuclera的篩選和放大試劑盒，分別在不同條件下表達嗜熱菌蛋白酶。為了單獨分析這些金屬離子在表達階段的作用，所有實驗組的蛋白純化過程均未添加金屬離子添加劑（圖 3A）。

通過熒光蛋白酶活性測定法檢測各純化蛋白的活性：蛋白酶催化熒光標記的蛋白底物水解后，會解除底物的熒光淬滅狀態，產生的熒光信號強度與蛋白酶活性呈直接正相關。實驗結果與已發表文獻一致：嗜熱菌蛋白酶的活性依賴于表達過程中鋅離子的存在，而與鈣離子無關（圖 3B）；即使將鈣離子與鋅離子聯合添加，也未觀察到酶活性的進一步提升，這可能是因為實驗未設置高溫條件對酶進行熱應激挑戰。這些結果證實，在表達階段添加鋅離子對于制備具有活性的鋅金屬蛋白酶十分重要。

案例2：錳離子（Mn2?）作為添加劑助力活性蛋白表達

為進一步探究金屬離子添加劑對蛋白質折疊環境的定制化調控作用，我們分析了Mn2?對人精氨酸酶-1（ARG1）的影響。ARG1是一種同源三聚體錳結合金屬酶，參與精氨酸代謝過程，該酶缺乏會導致高精氨酸血癥。研究人員構建了無標簽和 SUMO 標簽的ARG1線性表達構建體，并分別在不同條件下進行表達（圖 4A）。

蛋白純化后，通過精氨酸酶活性測定法檢測其活性：ARG1催化反應生成尿素，尿素引發的顏色變化程度與酶活性呈正相關。活性檢測結果顯示，在表達過程中添加Mn2?可顯著提高純化后酶的活性（圖 4B）。

案例1：有機輔因子磷酸吡哆醛（PLP）作為添加劑，可提升蛋白純化產量與活性

天冬氨酸轉氨酶（AAT）長期以來一直被用作研究模型蛋白，用于解析磷酸吡哆醛（PLP）依賴型酶的作用機制及其在氨基酸代謝中的功能。本研究評估了含 PLP 的 “輔因子混合物" 作為添加劑，對AAT表達及純化產量的影響。結果顯示，在含 PLP 的條件下表達的 AAT，其純化蛋白產量是不含 PLP 無細胞混合物中表達產物的 2 倍（圖 5A、圖 5B）。此外，通過熒光法 AAT 活性檢測發現，僅在含 PLP 條件下表達的純化 AAT 具有活性（圖 5C）。這些結果證實，表達階段添加有機輔因子 PLP，對于提升 AAT 的純化產量及酶活性十分重要。

案例2：金屬離子與有機輔因子組合作為添加劑，助力活性蛋白表達

乙醇脫氫酶 1A（ADH1A）是一種二聚體酶，依賴鋅離子（Zn2?）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）發揮作用，參與乙醇代謝過程。本研究分別在不同的無細胞混合物中表達 ADH1A（圖 6A），并通過比色法乙醇脫氫酶活性測定法檢測各純化蛋白的活性。

結果顯示：與未定制化的無細胞混合物（對照組）相比，單獨添加Zn2?或單獨添加含 NAD 的輔因子混合物，均能提升純化后 ADH1A 的活性；但僅當Zn2?與含 NAD 的輔因子混合物聯合添加時，才能觀察到最高的酶活性（圖 6B）。這一結果表明，將金屬離子與有機輔因子組合作為添加劑，可助力制備活性MAX的人類蛋白。

案例：分子伴侶混合物 DnaK 作為添加劑，促進蛋白正確折疊

熒光素酶因在熱激條件下易發生聚集，且可通過生物發光法便捷檢測其正確折疊狀態與活性，長期以來一直被用作研究 DnaK 等分子伴侶重折疊機制的模型蛋白。本研究將 DnaK 混合物作為添加劑，驗證其在翻譯過程中對熒光素酶折疊的影響。

研究人員構建了海洋橈足類熒光素酶（GLuc）的線性表達構建體，并分別在添加和未添加 DnaK 混合物的無細胞混合物中進行蛋白表達（圖 7A）。活性檢測結果顯示：與僅添加緩沖液的對照組相比，在含 DnaK 混合物的無細胞體系中表達的 GLuc，其活性提升了 1 倍（圖 7B）。該結果證實，分子伴侶的存在可促進蛋白質正確折疊并提高其可溶性，進而提升蛋白活性。

案例：GSSG與PDI組合作為添加劑，促進含二硫鍵蛋白正確折疊

GLuc含有5個二硫鍵，而這些二硫鍵是其實現最大生物發光活性的必需條件。因此，本研究再次選用 GLuc 作為模型蛋白，在添加了PDI與GSSG的定制化無細胞混合物中進行表達（圖 8A）。

實驗結果顯示：與標準還原條件下的表達相比，單獨添加 GSSG 即可提升 GLuc 的活性；而當 GSSG 與 PDI 聯合使用時，GLuc 的活性提升幅度更為顯著（圖 8B）。這一結果表明，在蛋白翻譯過程中定制化調控氧化還原環境，可通過促進含二硫鍵蛋白的正確折疊來提升其活性。此外，該實驗還證實，額外補充 PDI 能夠確保二硫鍵的正確排布，進而使蛋白活性達到最佳水平。