摘要：本文針對iPSC 3D懸浮培養的常見痛點，詳解PBS Mini中2D種子培養的標準化方案、關鍵參數與進階技巧，助力實現從2D到3D的平穩過渡，為細胞治療規模化生產提供可靠支撐。

關鍵詞：ipsc,誘導多能干細胞,iPSC培養,3D聚集體培養,垂直輪生物反應器,2D種子培養, iPSC聚集體培養,PBS Mini生物反應器,細胞治療規模化,灌流生物反應器

PBS Mini中iPSC聚集體培養標準化攻略

在細胞治療從實驗室走向臨床的進程中，多能干細胞（PSC）的規模化、標準化培養始終是核心瓶頸。許多具備成熟2D PSC培養經驗的研究者，在轉向3D懸浮放大時，常常遭遇細胞擴增效率低、批次間差異大、干性丟失、細胞庫資源消耗過快等難題。

作為PBS垂直輪生物反應器的核心技術合作伙伴，曼博生物始終致力于為中國區生物制藥研究者提供從工藝開發到規模化生產的技術支持方案。基于PBS Biotech近期發布的標準化工藝數據，我們為大家拆解PSC聚集體培養中較關鍵的2D種子培養環節，助力您實現從2D到3D的平穩過渡，打造穩健、可重復的細胞治療生產工藝。

一、為什么2D種子培養是3D培養及放大的“基石"？

接種到生物反應器中的細胞質量決定了第三代培養的成功與否。在進行3D培養之前，必須在2D培養中擴增細胞，我們稱之為2D培養（2D Seed Train）。這一過程有幾個目的：

?首先是生產足夠數量的細胞，以便接種到大規模的培養體系如生物反應器中；

?其次，通過減少所需細胞數量來保護母細胞庫資源；

?此外，還能幫助細胞在較低壓力的環境中恢復先前的保存狀態，從而減少3D培養中的滯育時間；

?最后，避免在3D培養中多次傳代，這可能導致基因不穩定性。

圖1.2D種子訓練流程

二、PBS Biotech標準化2D種子培養方案及參數

以下是PBS Biolab實驗室推薦的2D培養參數，如接種密度、培養時間、換液策略、酶解時間以及離心設置，這些參數已在各種2D培養容器中驗證，包括培養板、培養瓶等。該協議已經在多種誘導型干細胞系、干細胞培養基、細胞外基質涂層基質和相關科學中進行過測試，且一貫地能夠產生高質量的PSC，準備接種到3D培養中。

圖2.推薦的2D種子訓練培養參數

關鍵試劑使用規范

ROCK抑制劑（Y-26732）是單細胞接種的核心保障，推薦在以下三個環節使用10 µM工作濃度：

1. 單細胞懸液的稀釋與重懸

2. 培養容器中預分裝的培養基

3. 細胞解離酶溶液

三、材料選擇：經過驗證的兼容試劑清單

試劑的質量和兼容性直接影響工藝穩定性。對于不同研發需求，不一定要使用這些確切的材料。較佳的材料選擇應是那些與研究所用的細胞系兼容且滿足成本、供應、可用性、質量認證以及是否化學定義等要求的材料。

PBS Biolab團隊已經篩選了多種PSC培養試劑的組合，結果表明，它們與其推薦的2D培養到3D聚集體培養協議沒有任何不兼容的情況。如果老師們在使用選定的試劑時沒有成功，建議嘗試其他試劑。在開始工藝開發研究時，盡可能進行多種物料篩選，并查看哪些對您的細胞系較有效。如下圖所示，PBS反應器Biolab團隊嘗試過的每種市售培養基都能夠支持iPSC在3D培養中的聚集和擴增。因此在開始時，建議老師們嘗試幾種不同的選擇，以便根據下游目標和限制，找到較適合您細胞系的培養基。

圖3.經證實與PBS反應器Biolab團隊推薦的2D和3D培養方案兼容的材料

根據您的應用，您的2D培養方案可能不全部遵循我們的建議，但在轉向3D培養之前，建議對2D培養進行充分表征，以便了解細胞預期的生長、形態和pH變化，并確保其可重復性（即在全部相同的操作條件下得到相同的結果）以及其穩健性（即在改變一些非關鍵變量，如操作員、物料批次或同一細胞系的微小差異時，仍能得到類似結果）。確保2D培養系統充分理解并得到良好控制，是推進到3D培養之前的關鍵步驟，這樣才能公平評估和比較3D培養中的實驗結果。

四、工藝穩健性：可重復的產量與細胞質量

如果遵循推薦的2D培養協議，雖不同的細胞系會表現不同，但下圖中這些數據代表了30次獨立操作的平均值，標準差表示誤差范圍，可以參考下。在使用推薦的protocol時，細胞從冷凍保存恢復的初期，初次傳代時，細胞的倍增時間較長，而在2D培養中進行的累積倍增數則十分穩定，顯示出protocol的可重復性。總的來說，一套合格的種子培養工藝，必須在不同操作人員、不同細胞系間保持穩定。

圖4.驗證二維種子訓練protocol穩健且可重復

以下是遵循2D種子訓練protocol，多次重復下預期收獲細胞密度和細胞倍增數值：

（1）P+1階段：收獲細胞密度1.52±0.37×10?個活細胞/cm2，細胞擴增倍數10.1±2.1倍，倍增時間21.6±2.4小時

（2）P+2階段：收獲細胞密度2.44±0.40×10?個活細胞/cm2，擴增倍數56.3±9.2倍，倍增時間16.5±0.8小時

在細胞形態方面，在2D培養中，iPSC的形態應該是緊密排列的、具有清晰邊緣的獨立群體。

圖5.2D種子培養P+1期的典型形態

P+1階段應呈現邊界清晰、緊密聚集的典型PSC克隆；P+2階段細胞匯合度均勻，無明顯分化區域，為后續3D接種提供均一的單細胞懸液。

圖6.2D種子訓練P+2 階段iPSC的典型形態

在收獲和傳代時，細胞應該處于指數生長階段，而不是過度融合，在培養基中的pH值應保持在生理范圍內，約為7.8至7.4。過度融合意味著細胞在培養瓶表面覆蓋超過90%的面積，細胞開始相互重疊。在此階段，需要進行表征研究，以確定特定細胞類型和工藝下細胞數和pH的適宜范圍。

五、進階技巧與工藝探索

直接解凍法：簡化種子培養流程

對于高質量的工作細胞庫，可采用“直接解凍單細胞接種"的方式，進一步縮短種子培養周期。但需滿足兩個前提：

1. 凍存細胞具有較高的活性和明確的質量表征

2. 使用高密度工作細胞庫（WCB）進行接種

注意：并非所有細胞系和細胞類型都適用這種方法，建議先通過2D培養熟悉3D培養技術，再嘗試較為復雜的直接接種法。如果確實嘗試直接解凍接種法，確保您低溫保存的細胞經過充分表征，并且質量良好。

灌流培養iPSC聚集體

傳統的沉降式換液會導致聚集體大小不均一，嚴重影響細胞擴增和分化效率。PBS-0.5L 生物反應器現已集成原位灌流功能，能夠實現連續的培養基交換，維持培養環境的穩定性，獲得大小均一的 PSC 聚集體。關于灌流培養的詳細細節，可以聯系曼博生物獲取PBS技術支持。

圖7.灌流培養基交換有助于形成更均勻的細胞團形態。這對于細胞的有效擴增和分化比較重要

六、結語

從2D種子培養到3D規模化擴增，再到后續分化，每一個環節的標準化都決定了細胞治療產品的交付質量。PBS垂直輪生物反應器憑借獨特的垂直輪攪拌設計，結合我們提供的全流程工藝支持，能夠幫助研究者快速實現iPSC培養的工藝轉移和規模放大。

曼博生物作為PBS Biotech在中國合作伙伴，擁有專業的技術支持團隊，可提供從PBS垂直輪生物反應器設備安裝、工藝開發到問題排查的一站式服務。

如果您在iPSC聚集體培養過程中遇到任何問題，歡迎在評論區留言，或直接聯系我們的技術工程師。

下期預告：《PBS Mini中iPSC聚集體3D培養系列2：PBS Mini反應器中如何實現高效接種？》，敬請關注！

本文基于PBS Biotech公開技術資料，由上海曼博生物整理，僅用于科研信息分享。曼博生物可提供PBS垂直輪生物反應器、iPSC規模化培養、3D聚集體培養及細胞治療工藝開發相關產品與技術支持。可掃描下方圖片訪問曼博生物網站查看PBS生物反應器關于iPSC誘導多能干細胞培養具體解決方案。