肺腫瘤細(xì)胞微球與PBMC細(xì)胞免疫共培養(yǎng)解決方案

近年來，CAR-T/NK細(xì)胞免疫療法在實(shí)體瘤治療研究領(lǐng)域中非常火熱。隨著細(xì)胞免疫治療的興起也推動(dòng)了實(shí)體瘤研究的發(fā)展，但是由于人源化體系的復(fù)雜性、免疫系統(tǒng)的部分或無效重組建等問題，致使免疫腫瘤模型面臨著巨大的挑戰(zhàn)，臨床上迫切需要能夠用于個(gè)體化驗(yàn)證療效的體外模型。細(xì)胞微球?yàn)榧?xì)胞免疫治療在實(shí)體瘤中的研究提供了新的契機(jī)。然而，現(xiàn)有的細(xì)胞微球培養(yǎng)方法中有許多限制因素阻礙了腫瘤細(xì)胞微球與免疫細(xì)胞充分接觸。

InSphero 3D微球培養(yǎng)板為獲得大小均一的腫瘤細(xì)胞微球提供了新的解決方案，同時(shí)為細(xì)胞微球與免疫細(xì)胞共培養(yǎng)提供一種新的選擇。本文中小編將為大家分享一篇腫瘤細(xì)胞微球與免疫細(xì)胞共培養(yǎng)的解決方案。

肺腫瘤細(xì)胞微球與PBMC細(xì)胞免疫共培養(yǎng)解決方案

01- 試劑耗材

• 凍存的A549–GFP/hDF細(xì)胞

• 適宜的細(xì)胞培養(yǎng)基

• T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶（Greiner，658175）

• InSphero Akura 96/384 Spheroid Microplate

• 無菌PBS緩沖液（無鈣鎂離子）

• 胰酶

• 70%乙醇

• 血球計(jì)數(shù)板

• 水浴鍋（設(shè)置在37℃）

• 血清移液管（5ml和10ml）

• 離心機(jī)

• 一級生物安全柜

• 二氧化碳培養(yǎng)箱（設(shè)置在5% CO2濃度和37℃）

• 倒置顯微鏡

• 15ml無菌離心管

• 多通道移液器、適配的無菌吸頭、無菌試劑槽

02- 細(xì)胞擴(kuò)增

注意：所有實(shí)驗(yàn)步驟遵照無菌操作規(guī)范在生物安全柜中操作。

1、確保所有細(xì)胞培養(yǎng)基標(biāo)記清晰并在正確的條件下存放。

2、將培養(yǎng)基預(yù)熱至37℃。

3、向T75中加入5ml預(yù)熱的培養(yǎng)基。

4、在水浴鍋中快速融化細(xì)胞。

5、使用血清移液管吸取5ml預(yù)熱的培養(yǎng)基，并于融化的細(xì)胞混合，將混勻液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中。

6、室溫下離心，200 RCF 2min，棄去上清液，并用5ml預(yù)熱培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

7、將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至T75中。

8、將T75轉(zhuǎn)移至二氧化碳培養(yǎng)箱中。

9、培養(yǎng)24h后，更換培養(yǎng)基，并在顯微鏡下檢查細(xì)胞貼附情況。

10、當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70-80%交匯度時(shí)（約48h）可以用于下游的細(xì)胞微球培養(yǎng)。

03- 細(xì)胞懸液制備

1. 將培養(yǎng)基預(yù)熱至37℃。

2. 將T75從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出，使用血清移液管棄去培養(yǎng)基。

3. 向T75中加入10ml的PBS。

4. 輕輕搖晃培養(yǎng)瓶后棄去PBS。

5. 加入1ml的胰酶（1x），于37℃孵育5min。

6. 加入9ml的培養(yǎng)基（含F(xiàn)BS）終止消化。

7. 將細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至15ml離心管。

8. 室溫下離心，200 RCF 2min，棄去上清液，并用適量（取決于細(xì)胞壓積）預(yù)熱培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

9. 使用血球計(jì)數(shù)器（或其他細(xì)胞技術(shù)方法）進(jìn)行計(jì)數(shù)。

10. 調(diào)整細(xì)胞密度至12500cells/ml（即500 cells/40μl）。

04- 細(xì)胞微球構(gòu)建及培養(yǎng)（圖1）

圖1 Akura 96孔微球培養(yǎng)板的使用流程

1、使用70%乙醇擦拭Akura培養(yǎng)板的外包裝，并在生物安全柜中取出Akura培養(yǎng)板。

2、將單細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至試劑槽中，使用移液器輕輕吹打細(xì)胞懸液以保證濃度均一。

3、使用多通道移液器或自動(dòng)化工作站將細(xì)胞種植至Akura培養(yǎng)板，每孔70μl。

4、蓋上板蓋，室溫下離心，250 RCF 2min。

5、將培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移至濕潤的二氧化碳培養(yǎng)箱中，并保持斜立（與水平面夾角30度，圖1）。此過程可以使用InSphero專門設(shè)計(jì)的Akura斜立支架（圖2，InSphero，CS-10-002-00）或?qū)⑴囵B(yǎng)板的一側(cè)墊高。

圖2 Akura斜立支架（InSphero，CS-10-002-00）

05- 細(xì)胞微球與PBMC共培養(yǎng)

1. 用初始直徑約為250µm的A549-GFP/hDF細(xì)胞微球與免疫細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。

2. PBMC細(xì)胞按照制造商說明書進(jìn)行復(fù)蘇；

3. PBMC用anti-CD3（5ng/ml）和anti-CD28（250ng/ml）預(yù)處理24h；或不做處理（T-cell-na?ve）。

4. 抗體預(yù)孵育的PBMC使用A549–GFP/hDF培養(yǎng)基洗滌3次；

5. PBMC在A549–GFP/hDF培養(yǎng)基中穩(wěn)定培養(yǎng)24h；

6. PBMC用10 µg/mL的CellTracker Deep Red dye（cat. no. C34565）在37℃條件下染色1h；

7. A549–GFP/hDF細(xì)胞微球與PBMC在insphero 384微球培養(yǎng)板中共培養(yǎng)（10:1 E:T rate）；

8. 使用3D活細(xì)胞成像設(shè)置監(jiān)測腫瘤微組織內(nèi)的免疫細(xì)胞的浸潤39小時(shí)。

06- 結(jié)果

肺癌細(xì)胞腫瘤微球與免疫細(xì)胞共培養(yǎng)的活細(xì)胞成像結(jié)果如圖3所示，其中紅色為免疫細(xì)胞；綠色為A549-GFP/hDF細(xì)胞；該研究中對No PBMCs、na?ve PBMCs、Activated PBMCs三個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別選取0、4h和37h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行分析。結(jié)果表明Activated PBMCs在37h時(shí)可以有效殺死A549腫瘤微球中的細(xì)胞。

圖3 3D肺癌模型中免疫細(xì)胞浸潤的活細(xì)胞成像

07- 結(jié)論

InSphero微球培養(yǎng)板是為3D細(xì)胞模型的常規(guī)生成和長期培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的。超低吸附材質(zhì)制備的孔底可以確保細(xì)胞微球在生長過程中不會粘附在板底部。Insphero微球培養(yǎng)板在進(jìn)行細(xì)胞微球培養(yǎng)時(shí)，通過在每個(gè)孔中接種相同數(shù)量的腫瘤細(xì)胞，可以為免疫細(xì)胞共培養(yǎng)提供良好一致性的細(xì)胞微球。此外，Insphero微球培養(yǎng)板特殊的孔結(jié)構(gòu)為細(xì)胞微球和免疫細(xì)胞提供了更加擁擠的微環(huán)境，使免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞充分接觸以達(dá)到較好的殺傷效果。

參考文獻(xiàn)

[1] Wardwell-Swanson J,Suzuki M,Dowell K G,et al. A Framework for Optimizing High-Content Imaging of 3D Models for Drug Discovery:[J]. SLAS Discovery,2020,25(7):709-722.

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