摘要：eProtein Discovery蛋白表達篩選系統(tǒng)可通過定制化添加劑組合優(yōu)化蛋白表達條件，快速獲得結(jié)構(gòu)正確、具備生物活性的蛋白

一、無細胞蛋白表達篩選系統(tǒng)：傳統(tǒng)表達體系痛點與技術(shù)突破

在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究中，不同蛋白的折疊條件存在明顯差異，只有匹配適宜的表達環(huán)境，才能形成正確構(gòu)象并維持穩(wěn)定的生物活性。傳統(tǒng)表達體系對反應(yīng)環(huán)境的可調(diào)空間有限，在處理金屬蛋白酶、含二硫鍵蛋白、易聚集蛋白等復(fù)雜類型蛋白時，常常出現(xiàn)折疊異常、活性偏低、產(chǎn)量不足等問題。

無細胞系統(tǒng)具有開放、可靈活調(diào)控的反應(yīng)體系，支持根據(jù)目標(biāo)蛋白需求，添加輔因子、分子伴侶、氧化還原調(diào)節(jié)劑等成分，實現(xiàn)表達條件的個性定制與優(yōu)化。eProtein Discovery無細胞蛋白表達篩選系統(tǒng)由nuclera開發(fā)，將數(shù)字微流控篩選技術(shù)與無細胞蛋白合成相結(jié)合，能夠在短時間內(nèi)完成多組表達條件的并行測試，快速找到適配目標(biāo)蛋白的添加劑組合，有效提升蛋白的可溶性、表達產(chǎn)量與生物活性。曼博生物是nuclera在中國直售提供提供商，可咨詢曼博生物提供的eProtein Discovery蛋白表達篩選系統(tǒng)產(chǎn)品信息。

圖1：利用獨特的無細胞混合物體系（Cell-free Blend）進行蛋白表達與純化篩選，隨后開展蛋白放大與活性驗證。

二、系統(tǒng)組成與添加劑配置

eProtein Discovery無細胞蛋白表達篩選系統(tǒng)支持24種DNA構(gòu)建體與8種無細胞反應(yīng)體系進行高通量全自動組合篩選，單次實驗可生成192組表達條件，24小時內(nèi)完成表達檢測與初步純化分析，48小時即可獲得用于下游實驗的活性蛋白。

無細胞反應(yīng)體系由純化的無細胞核心試劑和添加劑組合形成，系統(tǒng)配套10種標(biāo)準(zhǔn)添加劑，能夠覆蓋大多數(shù)蛋白的折疊與表達需求，添加劑可單獨使用，也可組合使用（單一體系可添加2種），可形成約55種定制化無細胞反應(yīng)體系，具體包括：

1.金屬離子：Zn2?、Mn2?、Ca2?

2.有機輔因子：NAD、PLP、FAD、Acetyl-CoA、SAM

3.分子伴侶：TrxB1、DnaK伴侶混合物

4.氧化還原調(diào)節(jié)劑：PDI/GSSG、GSSG

5.工具酶：3C蛋白酶（用于可溶性標(biāo)簽的切除）

圖2：10種標(biāo)準(zhǔn)添加劑及其功能。

三、添加劑對蛋白表達的影響與案例

1. 金屬離子

據(jù)相關(guān)研究統(tǒng)計，約25%–50%的蛋白質(zhì)屬于金屬結(jié)合蛋白，金屬離子在蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定與酶活催化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

·Zn2?：是嗜熱菌蛋白酶的必需輔因子，表達體系中添加Zn2?后可檢測到明顯酶活性，不添加則無活性；Ca2?可提升該酶的熱穩(wěn)定性，但對基礎(chǔ)催化活性無明顯影響。

·Mn2?：是人精氨酸酶ARG1的關(guān)鍵輔因子，在體系中添加Mn2?后，ARG1的酶活性可提升約5倍。

2. 有機輔因子

有機小分子輔因子參與酶促反應(yīng)與蛋白構(gòu)象維持，可同時提升蛋白的表達產(chǎn)量與生物活性。

·PLP（磷酸吡哆醛）：是天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶AAT的必需輔因子，添加PLP后，AAT的純化產(chǎn)量可提升1倍，且蛋白能夠檢測出明確活性。

·NAD + Zn2? 組合：乙醇脫氫酶ADH1A需要同時搭配金屬離子與有機輔因子，才能達到理想的酶活性水平。

3. 分子伴侶

分子伴侶能夠減少蛋白聚集、協(xié)助蛋白完成正確折疊，從而提升蛋白的可溶性與活性。

·DnaK 混合物：對易發(fā)生錯誤折疊的熒光素酶GLuc具有明顯的保護作用，可使GLuc的蛋白活性提升約1倍。

4. 氧化還原調(diào)節(jié)劑

氧化還原環(huán)境直接影響二硫鍵的正確形成，而約1/4的哺乳動物蛋白含有二硫鍵，這類蛋白對表達體系的氧化還原狀態(tài)較為敏感。

·GSSG + PDI：可共同調(diào)控氧化環(huán)境，并校正二硫鍵錯配問題，能夠明顯提升含多二硫鍵蛋白GLuc的生物活性。

四、添加劑選擇策略

在eProtein Discovery無細胞蛋白表達篩選系統(tǒng)中，用戶可根據(jù)目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)與特性，選擇對應(yīng)的添加劑組合，提升表達與篩選效率：

1.含金屬結(jié)合位點的蛋白：優(yōu)先添加Zn2?、Mn2?、Ca2?等金屬離子

2.輔酶依賴型酶類：加入NAD、PLP等有機輔因子

3.易聚集、折疊困難的蛋白：搭配TrxB1、DnaK分子伴侶

4.含多二硫鍵的蛋白：使用PDI/GSSG、GSSG調(diào)控氧化還原環(huán)境

5.需要切除可溶性標(biāo)簽的樣品：加入3C蛋白酶

圖3：添加劑指導(dǎo)決策樹。每種表達用無細胞混合物中至多可添加兩種添加劑。

五、結(jié)論

eProtein Discovery無細胞蛋白表達篩選系統(tǒng)憑借標(biāo)準(zhǔn)定制化或者自定義的添加劑體系，能夠為不同結(jié)構(gòu)、不同功能的蛋白提供適配的表達環(huán)境。金屬離子、有機輔因子、分子伴侶、氧化還原調(diào)節(jié)劑等成分，可單獨或協(xié)同發(fā)揮作用，提升蛋白的可溶性、純化產(chǎn)量與生物活性，適用于金屬酶、含二硫鍵蛋白、易聚集蛋白等多種傳統(tǒng)體系難以表達的可溶性蛋白和膜蛋白（GPCR等）的制備與研究。

六、常見問題QA

Q1：eProtein Discovery無細胞蛋白表達篩選系統(tǒng)適合表達哪些類型的蛋白？

A1：該系統(tǒng)適用范圍廣，包括金屬結(jié)合蛋白、含二硫鍵蛋白、易聚集蛋白、毒性蛋白、膜蛋白（GPCR等）等傳統(tǒng)表達體系較難制備的蛋白，同時也可用于常規(guī)可溶性蛋白的快速制備與篩選。

Q2：一套系統(tǒng)單次可以同時篩選多少種表達條件？

A2：根據(jù)蛋白類型：針對可溶性蛋白，系統(tǒng)支持24種DNA構(gòu)建體與8種無細胞混合體系組合篩選，單次實驗可并行完成192種表達條件的篩選與分析；針對膜蛋白，系統(tǒng)支持11種DNA構(gòu)建體與8種無細胞混合體系組合篩選，單次實驗可并行完成88種表達條件的篩選與分析。

Q3：系統(tǒng)配套的添加劑需要自行配制嗎？

A3：不需要。系統(tǒng)提供10種即用型標(biāo)準(zhǔn)化添加劑，兼容性均經(jīng)過實驗驗證，可直接按需求組合使用，無需額外配制。

Q4：從DNA序列到獲得活性蛋白，整個流程需要多長時間？

A4：在標(biāo)準(zhǔn)流程下，系統(tǒng)可在48小時內(nèi)完成從DNA輸入、表達條件篩選、放大制備到活性蛋白產(chǎn)出的全流程。

Q5：該系統(tǒng)的篩選結(jié)果可以用來指導(dǎo)體內(nèi)表達嗎？

A5：可以。系統(tǒng)篩選得到的理想的DNA構(gòu)建體、可溶性標(biāo)簽、添加劑條件等結(jié)果，可直接用于大腸桿菌等體內(nèi)表達體系的菌株選擇與質(zhì)粒設(shè)計。

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