摘要：借助數字微流控無細胞蛋白合成系統，高通量篩選明確植物球蛋白表達與穩定性的關鍵決定因子

關鍵詞：無細胞蛋白合成、無細胞蛋白表達、數字微流控、植物球蛋白、高通量篩選、難表達蛋白、膜蛋白、蛋白穩定性、可溶性標簽、半胱氨酸突變、血紅素蛋白

一、植物球蛋白無細胞表達研究簡述

1.1 本文摘要

血紅素蛋白參與機體代謝與應激應答，但存在細胞毒性、折疊困難、傳統活細胞表達產量低、通用方案無法跨物種復用，植物球蛋白（Pgbs）就是典型代表。本文利用數字微流控無細胞蛋白合成（DMF-CFPS）技術高通量并行篩選可溶性標簽、氧化還原添加劑、半胱氨酸突變為丙氨酸三大變量，明確調控植物球蛋白無細胞蛋白表達與蛋白穩定性的關鍵決定因子。本研究選取兩種優勢突變體進行放大表達，成功獲得可溶性脫輔基球蛋白。研究結果證實，無細胞蛋白合成（CFPS）技術可快速、平行篩選蛋白理想表達條件，同時闡明保守半胱氨酸、氧化還原環境在植物球蛋白合成成熟過程中的作用。

1.2 研究對象

● 甜菜1型植物球蛋白野生型BvPgb 1.2及保守半胱氨酸突變體C86A；

● 全新鑒定8個燕麥植物球蛋白AsPgb，分3個同源組：1型兩組（AsPgb1.1–1.3、AsPgb1.4–1.6）、3型一組（AsPgb3.1–3.2）；3組定點突變體：AsPgb1.1-C70A、AsPgb1.5-C84A、AsPgb3.1-C161A（保守C→A替換）；

二、傳統蛋白表達體系局限與CFPS應用研究背景

2.1. 血紅素/植物球蛋白表達瓶頸

植物球蛋白（Pgbs）參與NO清除、氧化應激調控，屬于典型難表達血紅素蛋白：脫輔基球蛋白易聚集、血紅素對宿主細胞有毒、合成與血紅素插入難以同步；針對一種Pgbs優化的表達條件無法直接套用至同源蛋白，傳統體內表達需要數周試錯，通量低。

2.2 保守半胱氨酸的未知作用

Pgbs序列高度保守半胱氨酸殘基，易形成錯配二硫鍵、引發氧化聚集；C突變為A可消除巰基，但該突變對不同Pgbs表達量、可溶性、熱穩定性的影響缺乏系統對比。

2.3 傳統篩選局限性

活細胞篩選受轉化效率、細胞毒性限制；常規96孔CFPS體系試劑消耗大、條件并行數量少；數字微流控（電潤濕操控納升級液滴）實現全自動高通量并行篩選，48小時內可完成192組表達條件測試，大幅縮短優化周期。

三、實驗方法（DMF-CFPS完整解決方案）

3.1 數字微流控卡盒工作原理

nuclera eProtein Discovery系統配套專用卡盒依托介電上電潤濕實現納升級液滴獨立移動、混合、孵育、磁珠純化；卡盒集成多試劑儲液孔，可自動完成CFPS合成、BiFC熒光定量、鏈霉親和素磁珠原位純化整套流程；通過雙分子熒光互補BiFC實時定量蛋白表達濃度。

3.2 eGene線性DNA模板構建

利用Nuclera eGene可溶性標簽試劑盒PCR組裝得到整套eGene線性表達模板。線性模板兩端分別攜帶：

● N端：7種可溶性標簽（P17/CUSF/FH8/TRX/SUMO/ZZ/SNUT）或無標簽+3C蛋白酶酶切位點；

● C端：TEV酶切位點+GFP檢測標簽+Strep純化標簽；

圖1 eGene模板結構示意圖

采用一步式PCR批量構建所有野生型與C→A突變eGene構建體，包含BvPgb 1.2、C86A、AsPgb 1.1、C70A、AsPgb 1.5、C84A、AsPgb 3.1、C161A。歸一化濃度后進行卡盒上樣。

3.3 配置無細胞反應液（CFB）

制備8組無細胞反應體系（CFB），每體系含無細胞核心試劑、定制氯化血紅素補充液（用于輔因子插入測試）和不同功能的添加劑（標準緩沖液、PDI+GSSG、GSSG、TRXB1、DnaK分子伴侶混合液、金屬輔因子混合液、Zn2?、3C蛋白酶），加樣至卡盒對應孔。

3.4 兩種卡盒篩選

● 3×8（甜菜BvPgb篩選）：2種蛋白（WT/C86A）×（7種可溶性標簽+無標簽）×8組CFB，共128組條件；

● 6×4（燕麥AsPgb篩選）：6種蛋白（3WT+3突變）×（3種可溶性小標簽+無標簽）×8組CFB，共192組條件；

啟動可溶性蛋白篩選程序，自動篩選每組蛋白產量較高的組合（3×8選10組，6×4選5組）共30組，進行原位磁珠純化，從而輸出蛋白表達與純化產量圖譜。

圖2 用于無細胞蛋白合成（CFPS）的數字微流控卡盒

3.5 放大與蛋白表征

● 200 μL體系無細胞放大表達，Strep親和純化，SDS-PAGE驗證；

● 質譜光度MP：測定蛋白寡聚狀態；

● 納米差示掃描熒光nanoDSF：測定蛋白熔解溫度Tm，評估熱穩定性。

3.6 生物信息前期工作

● 燕麥全基因組BLAST挖掘8個全新AsPgb，完成組織表達譜（根、葉、種子、穎殼等）；

● ColabFold預測AsPgb三維結構，UCSF ChimeraX與已解析BvPgb1.2（PDB:7ZOS）骨架比對，RMSD＜1 ?，整體折疊高度同源，但表面電荷、局部疏水存在差異。

四、實驗結果

4.1 燕麥AsPgb基因與組織表達特征

1. 8個AsPgb分為3進化同源組，組內序列相似度＞90%；

● OG0017468（AsPgb1.1–1.3）：富集葉片、穎殼，種子表達低；

● OG0007273（AsPgb1.4–1.6）：種子、根高表達，穎殼無轉錄；

● OG0012302（AsPgb3.1–3.2）：全組織廣譜高表達；

2. 所有AsPgb在根系均可檢測到轉錄，與植物球蛋白參與根系氧化應激功能吻合。

表1. 不同同源組燕麥植物球蛋白（AsPgbs）在各組織中的檢出情況

注：數值為檢出陽性樣本數量，n代表該組織總樣本數；同源組合計為組內所有蛋白檢出總數，分母為該組織最大可檢出樣本數。

4.2 結構比對結論

AsPgb1.1、1.5與BvPgb1.2主鏈RMSD僅0.859、0.945 ?，血紅素結合口袋、保守半胱氨酸空間位置高度重合；但細微序列差異直接造成體內/體外表達行為不同。

表2 燕麥植物球蛋白預測結構與甜菜1型球蛋白標準晶體結構（BvPgb 1.2，PDB編號7ZOS）的疊合比對結果

圖3 AsPgb 1.1（橙色）、AsPgb 1.5（粉色）預測結構與BvPgb 1.2（藍色）主鏈疊合圖

4.3 微流控高通量篩選關鍵規律

1. 半胱氨酸C→A突變明顯改變表達/純化產率

● BvPgb C86A突變體：熒光表達總量高于野生型，純化總收率與WT持平；SUMO標簽強烈抑制野生型表達，但對C86A幾乎無負面影響；

● AsPgb1.1 C70A：純化收率高于野生；AsPgb1.5 C84A標簽依賴性大幅改變；AsPgb3.1 C161A純化效率大幅提升；

總體：消除保守巰基可減輕氧化聚集，多數Pgbs突變后可溶性、總產率提升，證明保守半胱氨酸是表達穩定性負向決定因子。

2. 氧化還原添加劑是Pgbs表達的關鍵調控因素

● GSSG（22%）、PDI/GSSG組合（26%）合計占優選反應體系48%，遠高于分子伴侶DnaK（2%）、TRXB1（4%）；

● 氧化微環境促進二硫鍵正確折疊、抑制巰基自發氧化聚集，是Pgbs穩定合成的核心條件；單純還原型伴侶提升效果微弱；

● 金屬輔因子混合液、Zn2?次之，可輔助血紅素結合口袋折疊。

3. 可溶性標簽具有蛋白/突變體特異性，小標簽更優

● 表現較優標簽集中在10 kDa以內：P17、CUSF、FH8；大標簽SUMO/TRX/ZZ/SNUT普遍抑制Pgbs表達；

● 無標簽體系占優選條件40%，說明標簽并非必需，部分Pgbs去除融合標簽后折疊更佳；3C蛋白酶添加組19%被選中，證實標簽會阻礙部分Pgbs折疊；

● 物種差異：CUSF較適配BvPgb WT，P17較適配AsPgb1.5。

圖4 各蛋白表達產量數據（μM），藍色塊產量＞8 μM，紅色塊產量＜8 μM

圖5 各優選組蛋白表達產量（綠色）、純化產量（藍色）和純化回收率（紅色圓點）

4.4 放大表達與蛋白理化表征

1. 條件放大：AsPgb 1.5與BvPgb 1.2序列同源性高，AsPgb 1.5選用P17標簽，BvPgb 1.2選用CUSF標簽；均采用篩選效果優的PDI/GSSG反應液。放大純化后獲得P17-AsPgb1.5（0.69 mg/mL，22 μM）和CUSF-BvPgb1.2（0.77 mg/mL，20 μM），純化后條帶單一；

2. 質譜光度MP：兩種蛋白均以單體為主（BvPgb單體占93%，AsPgb1.5單體72%），獲得高純度可溶性脫輔基apo-Pgb（無血紅素結合）；

3. 熱穩定性nanoDSF（數據未展示）：未開展完整熱力學分析，BvPgb熔解溫度Tm=55 ℃，高溫易聚集；AsPgb1.5熱轉變信號不清晰，穩定性弱于甜菜同源蛋白，解釋傳統方案無法跨物種復用。

圖6 P17-AsPgb 1.5（31 kDa）與CUSF-BvPgb 1.2（38 kDa）放大產物及寡聚狀態表征

五、總結與展望

本研究依托微流控無細胞蛋白合成（DMF-CFPS）體系，實現了血紅素結合球蛋白Pgbs高通量條件篩選，明確保守半胱氨酸易引發蛋白氧化聚集，將其突變為丙氨酸可大幅提升蛋白可溶性與純化回收率；由氧化型谷胱甘肽GSSG與二硫鍵異構酶PDI組成的氧化環境更利于Pgbs正確折疊，且小分子親水融合標簽適配性好，大分子量標簽會抑制蛋白折疊。不同物種同源Pgbs骨架雖保守，但序列差異導致理化性質與表達條件存在物種特異性，難以共用一套表達方案。

該體系可快速獲得穩定可溶的脫輔基apo-Pgb蛋白，彌補了天然蛋白易聚集的短板，但目前尚未完成血紅素嵌入及蛋白生物活性驗證，突變位點改造維度較為有限。后續可添加GAPDH分子伴侶實現成熟全功能holo-Pgb制備，NO清除、抗氧化等功能檢測，擴充氨基酸突變類型闡明巰基調控機理，并將這套高通量篩選系統拓展應用于膜蛋白、血紅素酶、毒性重組蛋白等各類難表達蛋白的研發與機制解析，為血紅素蛋白定向改造與應用開發提供技術支撐。

參考文獻

Groth, L.; Bülow, L. Digital Microffuidics-Driven Cell-Free Protein Synthesis Platform Reveals Expression and Stability Determinants for Phytoglobins and Cysteine-to-Alanine Substituted Variants. Antioxidants 2025, 14, 1317.

拓展閱讀

Nuclera無細胞蛋白表達篩選系統技術專欄（可訪問曼博生物查看）

本文基于Nuclera公開資料由中國抗體蛋白方案提供商上海曼博生物整理，用于科研信息分享、實驗參考等。上海曼博生物可提供Nuclera eProtein Discovery無細胞蛋白表達篩選系統、數字微流控無細胞蛋白合成系統、DMF-CFPS高通量蛋白篩選、eGene可溶性標簽試劑盒、難表達蛋白篩選、膜蛋白表達、血紅素蛋白表達、蛋白穩定性篩選及蛋白純化相關產品與技術支持，助力國內科研機構快速開展靶點驗證、膜蛋白表達、AI蛋白設計和酶的定向進化以及酶工程等相關研究，如您需要歡迎咨詢!

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