摘要：尿白蛋白/肌酐比值（UACR）可消除尿液濃縮稀釋干擾，是小鼠腎損傷、糖尿病腎病、藥物腎毒性研究中無創(chuàng)監(jiān)測腎功能的常用指標(biāo)。本文基于Albuwell M競爭性ELISA與改良Jaffe法的商業(yè)化檢測方案，詳細(xì)講解樣本采集處理、實(shí)驗(yàn)操作、結(jié)果換算的全流程要點(diǎn)，同時(shí)解析UACR數(shù)據(jù)的局限性與干擾因素，提示需結(jié)合多維度指標(biāo)綜合評估腎功能。

關(guān)鍵詞：UACR、尿白蛋白肌酐比值、小鼠腎功能檢測、尿白蛋白檢測、尿肌酐檢測、糖尿病腎病、腎損傷、Jaffe 法、Albuwell M檢測、藥物腎毒性

一、為什么小鼠腎功能研究會關(guān)注UACR？

在小鼠腎損傷、糖尿病腎病、藥物腎毒性及遺傳性腎病研究中，尿液檢測具備無創(chuàng)、可縱向追蹤同一動物的優(yōu)勢，能夠動態(tài)觀察腎臟濾過屏障功能、蛋白排泄水平及干預(yù)措施的效果。尿白蛋白升高通常提示腎小球?yàn)V過屏障的選擇性下降，是評估腎功能變化與模型表型的核心指標(biāo)之一。

但尿液并非濃度恒定的體液體系：動物飲水量、排尿量、采樣時(shí)段、采樣方式（代謝籠/點(diǎn)尿）等因素，都會對尿液的濃縮稀釋程度影響較大，進(jìn)而改變分析物的實(shí)際濃度。僅檢測尿白蛋白的絕對濃度，無法區(qū)分“腎臟損傷導(dǎo)致的蛋白排泄增加"與“尿液濃縮帶來的濃度升高"。

尿白蛋白/肌酐比值（urinaryalbumin-to-creatinineratio,UACR，也簡稱ACR）通過同步檢測同一份樣本中的尿白蛋白與尿肌酐，以肌酐為內(nèi)參校正尿液濃縮稀釋的影響，反映單位肌酐背景下的白蛋白排泄水平，有效提升不同樣本間的可比性。對于隨機(jī)尿、點(diǎn)尿樣本，這種歸一化方式的價(jià)值更為突出。

二、UACR檢測方法學(xué)原理

UACR由兩項(xiàng)獨(dú)立檢測的結(jié)果換算而來，目前小鼠研究中普遍使用的商業(yè)化組合為Ethos Exocell的Albuwell M（尿白蛋白檢測，貨號1011）與 Creatinine Companion（尿肌酐檢測，貨號1012），二者均為96孔板格式，可實(shí)現(xiàn)同批次樣本的并行檢測。

1.尿白蛋白檢測：直接競爭性ELISA（Albuwell M）

尿白蛋白檢測主要分為免疫化學(xué)法與體積排阻HPLC法，該試劑盒屬于免疫化學(xué)法中的ELISA技術(shù)，是目前小鼠尿白蛋白檢測較為常用的商業(yè)化方案之一。其采用直接競爭性抗體捕獲ELISA原理，微孔板預(yù)包被小鼠白蛋白，所有試劑為即用型液體。

• 反應(yīng)機(jī)制：向孔中加入樣本與辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗小鼠白蛋白抗體后，液相中的樣本白蛋白與固相包被的白蛋白競爭性結(jié)合酶標(biāo)抗體。樣本中白蛋白濃度越高，結(jié)合到固相的酶標(biāo)抗體越少。

• 顯色與定量：洗去未結(jié)合物質(zhì)后，加入四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物發(fā)生顯色反應(yīng)，硫酸終止后在450 nm波長下檢測吸光度。吸光度值與液相中白蛋白濃度的對數(shù)成反比，采用半對數(shù)方式擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

• 標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍：0.156~10 μg/mL（7個(gè)倍比稀釋濃度點(diǎn)）。

方法特點(diǎn)：對小鼠白蛋白高度特異性，操作簡便；洗板可使用自來水，條件不滿足時(shí)也可使用專用TEA洗板緩沖液。

圖1.Albuwell M (Mouse Albumin ELISA)檢測試劑盒，貨號1011

2.尿肌酐檢測：改良堿性C6H3N3O7法（Creatinine Companion）

該試劑盒基于經(jīng)典Jaffe堿性C6H3N3O7法改良，通過加酸前后雙波長差吸光度計(jì)算，校正非肌酐色原帶來的干擾，準(zhǔn)確性優(yōu)于傳統(tǒng)單一終點(diǎn)Jaffe法。與HPLC法相比，該方法成本更低、操作更簡便，適合批量樣本檢測。

• 反應(yīng)機(jī)制：堿性條件下，肌酐與C6H3N3O7反應(yīng)生成有色復(fù)合物；加入酸試劑后，該復(fù)合物特異性分解，而非肌酐色原的顯色不受影響。通過計(jì)算加酸前后的吸光度差值，可特異性反映肌酐濃度。

• 標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)置：包含1、3、10mg/dL三個(gè)濃度的肌酐標(biāo)準(zhǔn)品，檢測線性范圍為1\10mg/dL（即10\100μg/mL）。

方法特點(diǎn)：屬于化學(xué)比色法，無需抗體，操作快速；通過差吸光度有效降低了尿液中干擾物質(zhì)的影響。

圖2. The Creatinine Companion檢測試劑盒，貨號1012

三、尿液中白蛋白和肌酐檢測的完整實(shí)驗(yàn)操作流程

1.樣本采集與保存

（1）采樣方式

• 24小時(shí)尿樣：使用代謝籠收集，可完整記錄總排泄量，結(jié)果相對準(zhǔn)確，但操作相對復(fù)雜。

• 隨機(jī)尿/點(diǎn)尿樣：可通過腹部按摩、將小鼠放置于96孔板上方等方式采集，操作簡便但受濃縮稀釋影響大，必須結(jié)合肌酐校正。

• 采樣時(shí)需嚴(yán)格避免食物、糞便污染；血尿、精液污染的樣本不可使用——血液中白蛋白濃度約為正常尿液的2000倍，會導(dǎo)致結(jié)果嚴(yán)重偏高。

（2）樣本處理與保存

• 樣本采集后不加防腐劑，必要時(shí)通過離心澄清樣本。

• 短期保存：4℃條件下可存放至多1周。

• 長期保存：-60℃條件下可存放至多2個(gè)月；解凍需室溫自然進(jìn)行，禁止加熱解凍。

• 檢測前將樣本恢復(fù)至室溫，充分混勻。

2.尿白蛋白ELISA操作要點(diǎn)

1. 試劑準(zhǔn)備：所有試劑與樣本提前平衡至室溫。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：用NHEBSA稀釋液對MSA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行7次1:2倍比稀釋，得到0.156、0.313、0.625、1.25、2.5、5、10μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列。

3. 尿液樣本稀釋：

• 常規(guī)推薦1:21稀釋（10μL樣本+200μL稀釋液）。

• 初次開展實(shí)驗(yàn)時(shí)，建議設(shè)置原液、1:21、1:81三個(gè)稀釋度，確定落在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)的稀釋比例。

• 每份樣本更換全新吸頭，避免交叉污染。

4. 加樣與孵育：

• 設(shè)置陰性對照、陽性對照，標(biāo)準(zhǔn)品做復(fù)孔，樣本建議做復(fù)孔。

• 除陰性對照孔外，每孔加入酶標(biāo)抗體，封板后室溫孵育30分鐘。

5. 洗板與顯色：

• 洗板共10個(gè)循環(huán)，可使用自來水或洗板緩沖液。

• 加入TMB顯色液，室溫顯色5~10分鐘；加入終止液后，以陰性對照孔為空白，在450nm處讀取吸光度。

6. 結(jié)果計(jì)算：

• 以log??（白蛋白濃度）為橫軸，平均吸光度為縱軸，進(jìn)行半對數(shù)線性擬合。

• 將樣本吸光度代入公式，取反對數(shù)得到稀釋后濃度，乘以稀釋倍數(shù)得到原始尿液白蛋白濃度。

圖3. 尿白蛋白ELISA操作實(shí)驗(yàn)流程

3.尿肌酐檢測操作要點(diǎn)

1. 試劑準(zhǔn)備：檢測前將0.5 MNaOH與C6H3N3O7試劑按比例混合，配制堿性C6H3N3O7工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2. 樣本稀釋：推薦用蒸餾水做1:20稀釋，根據(jù)樣本實(shí)際濃度調(diào)整稀釋比例，確保結(jié)果落在線性范圍內(nèi)。

3. 加樣與反應(yīng)：

• 設(shè)置空白孔、三個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)孔、樣本復(fù)孔，每孔加入20μL標(biāo)準(zhǔn)品/樣本。

• 每孔加入100μL堿性C6H3N3O7工作液，室溫靜置10分鐘后，在波長下讀取初次吸光度。

• 每孔加入100μL酸試劑，室溫靜置5分鐘后，在相同波長下讀取第二次吸光度。

4. 結(jié)果計(jì)算：

• 計(jì)算每孔的吸光度差值ΔAbs=初次吸光度（堿性條件）-第二次吸光度（加酸后）。

• 以肌酐濃度為橫軸、ΔAbs為縱軸做線性回歸，代入樣本ΔAbs得到稀釋后濃度，乘以稀釋倍數(shù)得到原始尿液肌酐濃度。

圖4. 尿肌酐ELISA操作實(shí)驗(yàn)流程

4.UACR換算

將同一份樣本的尿白蛋白濃度除以尿肌酐濃度，統(tǒng)一單位后得到UACR值。常用單位包括μg/mg與mg/g，二者數(shù)值相等（1 mg/g=1 μg/mg）。

四、UACR數(shù)據(jù)的解讀

1.UACR數(shù)據(jù)的局限性與注意事項(xiàng)

• 品系與個(gè)體差異：不同小鼠品系、性別、年齡、體重、肌肉量的尿肌酐排泄水平存在較為明顯的差異，因此UACR更適用于同一模型體系內(nèi)的組間比較、同組動物的縱向追蹤，不適合跨品系、脫離模型背景的單純數(shù)值比較。

• 與24h尿白蛋白的一致性：小鼠點(diǎn)尿UACR與24小時(shí)尿白蛋白排泄量并非全部一致，這種差異與肌酐排泄的品系特異性相關(guān)。因此，糖尿病并發(fā)癥動物模型聯(lián)盟（AMDCC）推薦同時(shí)報(bào)告24小時(shí)尿白蛋白排泄量與UACR兩項(xiàng)指標(biāo)。

• 干擾因素：尿路感染、明顯高血糖、嚴(yán)重高血壓、充血性心力衰竭等病理狀態(tài)，以及運(yùn)動、水負(fù)荷、采樣體位等生理因素，均會影響尿白蛋白與肌酐的排泄，解讀結(jié)果時(shí)需充分考慮這些混雜因素。

• 方法學(xué)固有局限：尿白蛋白ELISA不可使用含NaN3的樣本，HRP抑制劑會干擾顯色結(jié)果；嚴(yán)重微生物污染的樣本也會影響檢測準(zhǔn)確性。

2.綜合評估腎功能的原則

UACR僅反映尿蛋白排泄的相對水平，不能作為腎功能評估的單一依據(jù)。完整的腎病表型評估，建議結(jié)合以下維度的指標(biāo)：

• 尿白蛋白絕對濃度、24小時(shí)尿白蛋白排泄總量

• 腎小球?yàn)V過率（GFR）：優(yōu)先選擇菊粉清除、FITC-司替星經(jīng)皮檢測、碘海醇清除等方法；肌酐清除率因腎小管分泌肌酐的影響（部分品系腎小管分泌肌酐占比可達(dá)50%），會明顯高估GFR，不推薦作為金標(biāo)準(zhǔn)。

• 腎組織病理：系膜基質(zhì)擴(kuò)張、腎小球基底膜厚度、足細(xì)胞數(shù)量、腎小管間質(zhì)纖維化等形態(tài)學(xué)指標(biāo)

• 腎小管損傷標(biāo)志物、炎癥與纖維化分子標(biāo)志物、整體代謝表型

五、總結(jié)

UACR的核心價(jià)值是為尿白蛋白數(shù)據(jù)提供標(biāo)準(zhǔn)化的歸一化方式，更適用于隨機(jī)尿、點(diǎn)尿樣本的組間比較，是小鼠縱向腎功能監(jiān)測的便捷工具。Albuwell M競爭性ELISA與Creatinine Companion改良Jaffe法的組合，是目前該領(lǐng)域科研中普遍使用的商業(yè)化方案。實(shí)驗(yàn)過程中需嚴(yán)格控制采樣、前處理、稀釋、孵育等環(huán)節(jié)的一致性，解讀數(shù)據(jù)時(shí)需充分認(rèn)識方法局限性，結(jié)合多維度指標(biāo)進(jìn)行綜合判斷。

本文基于公開實(shí)驗(yàn)資料由Ethos Biosciences中國提供商上海曼博生物整理，僅用于科研信息分享，具體實(shí)驗(yàn)方案需結(jié)合研究目的與模型特性進(jìn)行設(shè)計(jì)。上海曼博生物可提供Ethos Exocell Albuwell M小鼠白蛋白ELISA檢測試劑盒、Creatinine Companion尿肌酐檢測試劑盒及小鼠UACR定量檢測、小鼠白蛋白檢測試劑盒、尿肌酐檢測試劑盒及配套尿液樣本檢測相關(guān)試劑耗材（掃描下方圖片查看具體信息），支持糖尿病腎病、藥物腎毒性、遺傳性腎病等動物模型UACR定量檢測實(shí)驗(yàn)，如有需要?dú)g迎咨詢上海曼博更多試劑盒相關(guān)技術(shù)資料與產(chǎn)品信息。