摘要：本文基于DLS2026版Gentest Supersomes說明書，梳理五大代謝重組酶的適用場景、標準孵育流程、實驗控制要點與常見問題，為體外ADME實驗提供合規操作參考。

關鍵詞：重組代謝酶、Supersomes、CYP、UGT、ADMET、FMO、MAO、Gentest、NAT、體外藥物代謝

一、為什么選擇cDNA表達重組酶？

藥物代謝與ADMET研究是創新藥臨床前開發、IND申報的核心環節，傳統人肝微粒體、肝細胞體系酶系混雜，無法準確區分單一代謝亞型的催化作用，批次間個體差異大，弱代謝化合物檢出靈敏度不足。

Discovery Life Sciences旗下Gentest Supersomes是全球有名的體外代謝重組酶金標準試劑，依托桿狀病毒昆蟲細胞表達體系，單獨高表達單一人體代謝酶，覆蓋Ⅰ相、Ⅱ相全部主流代謝通路，解決傳統組織樣本的痛點：

1. 酶活力優異：催化活力高，線性孵育窗口可達60分鐘，適配慢代謝化合物代謝研究、代謝物大規模制備

2. 亞型單一純凈：分批次單獨表達CYP、UGT、FMO、MAO、NAT各類單一酶，無其他亞型干擾，可準確完成代謝表型分型

3. 批次穩定可溯源：每支產品附帶CofA質檢報告，標注酶含量、蛋白濃度、特征底物活力，數據合規可直接用于新藥申報；

4. 產品線完整：覆蓋五大代謝酶家族，配套專屬對照酶、輔酶再生體系、反應緩沖液，一站式搭建標準化孵育體系。

二、五大主流重組酶家族功能與適用場景

1.CYP（細胞色素P450）——Ⅰ相氧化代謝核心

CYP是人體藥物、外源物主要的代謝通路，屬于膜結合氧化血紅素蛋白，主要分布于肝臟，催化依賴NADPH再生體系提供還原當量，部分亞型的活力可被細胞色素b5進一步提升。

• 核心應用：代謝穩定性測試、CYP抑制IC50/Ki測定、反應表型分型、藥物相互作用DDI篩查、前藥活化研究；

• 推薦起始實驗條件：酶終濃度20–50pmole/mL，緩沖液選用50–100 mM Tris-HCl（pH7.5）或磷酸鉀（pH7.4）；

• 溶劑控制紅線：DMSO終濃度≤0.2%，乙腈≤2%，高濃度有機溶劑會明顯抑制CYP活力；

• 關鍵操作要點：-80℃避光保存，37℃快速水浴解凍后立即置于冰上，建議分裝減少凍融次數；優先采用先預熱底物+緩沖液+輔酶，再加冷酶啟動反應，保證線性動力學區間。

2.UGT（尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶）——Ⅱ相結合代謝主力

UGT負責底物羥基、羧基、氨基的葡萄糖醛酸化修飾，是藥物清除關鍵通路，常承接CYP氧化產物進行二次代謝。已知哺乳動物肝組織組分中的UGT催化活性存在“潛滯效應"1；實驗發現：Gentest Supersome（人重組UGT微粒體）體系內的UGT，其潛滯效應程度低于哺乳動物組織組分。

• 專屬關鍵試劑：必須添加25 μg/mL alamethicin解除膜封閉，輔酶采用UDPGA再生體系，終濃度2mM飽和濃度；

• 緩沖體系偏好：Tris-HCl（pH7.5）活力遠優于磷酸鹽緩沖液，Gentest提供5×濃縮UGT反應預混液（貨號451320）直接使用；

• 溶劑：DMSO、甲醇≤2%，乙腈≤1%；

• 起始酶濃度：0.4–0.8mg蛋白/mL，適用于各類底物清除與抑制動力學測定。

圖1.UGT反應混合液中試劑終濃度

3.FMO（黃素單加氧酶）——含N/S/P雜原子化合物專屬氧化通路

FMO與CYP底物存在重疊，二者區分依靠實驗設計：FMO熱敏感、偏好軟親核基團（如：氮、硫、磷等），催化限速步驟為NADPH還原酶活；人體FMO3多態性直接關聯三甲胺尿癥（魚腥味綜合征）。

• QC標準緩沖條件：使用pH 9.5甘氨酸緩沖液，與CYP中性緩沖體系嚴格區分；

• 起始蛋白濃度：0.1–0.5 mg/mL，適合胺類、硫醚類候選藥代謝通路區分實驗。

• 注意：禁止預熱酶后再加輔酶啟動反應，FMO在37℃、無NADPH的條件下會快速失活，必須預熱底物、緩沖液、輔酶后加入冷酶啟動；

4.MAO（單胺氧化酶）——單胺類神經遞質、曲坦類藥物主要代謝通路

MAO定位于線粒體膜，分為MAO-A、MAO-B兩種亞型，無需NADPH輔酶，底物、抑制劑高度選擇性：MAO-A靶向5-羥色胺、去甲腎上腺素，被氯吉蘭低濃度抑制；MAO-B偏好C8H11N、芐胺，較低濃度司來吉蘭即可阻斷活力。

• 基礎緩沖：100mM磷酸鉀pH7.4；溶劑：乙腈≤0.5%，DMSO/甲醇≤2%；

• 低酶活體系：推薦起始濃度僅0.05–0.1 mg/mL，避免底物快速耗盡；

• 典型應用：偏頭痛曲坦類藥物代謝、精神類單胺藥物清除、神經毒性外源物降解研究。

5.NAT（N-乙酰轉移酶）——胞質Ⅱ相結合代謝酶

NAT為可溶性胞質酶，依賴乙酰CoA再生系統催化芳香胺乙?；?，分NAT1、NAT2，在人群中存在基因多態性，是致癌物、抗炎芳香胺類藥物的主要代謝酶。

• 反應體系特點：酶活遠高于人肝胞液，起始濃度僅0.01–0.1 μg/mL即可滿足檢測；

• 緩沖液：采用50mM三乙醇胺（pH 7.5）；

• 輔酶體系：乙酰CoA+乙酰肉堿+肉堿乙酰轉移酶三聯再生系統。

圖2.NAT反應混合液中試劑終濃度

三、孵育實驗流程

(一)通用實驗前置要求

1. 儲存與解凍：Supersomes均-80℃保存，37℃水浴快速融化，全程冰上操作，未用完立即分裝凍存；

2. 對照設置：同步孵育對應昆蟲細胞空白對照酶，扣除細胞內源酶代謝干擾；涉及OR還原酶單獨作用時搭配b5對照（456244）；

3. 線性預實驗前置：正式動力學、抑制實驗前，摸索酶濃度梯度+時間梯度，保證底物消耗＜20%，避免非線性數據；

4. 終止與前處理：0.5–2倍體積乙腈終止酶活、沉淀蛋白，必要時加乙酸酸化適配LC-MS檢測；10000×g離心3min取上清進樣分析。

不同家族代謝酶研究體系簡要操作流程

1. CYP/FMO孵育體系：純水+磷酸鉀緩沖液+NADPH再生液A/B+底物，37℃預熱5min，加入重組酶啟動，0–60min梯度取樣；

2. UGT孵育體系：純水+UGT預混液+UDPGA輔酶+底物，預熱后加酶，alamethicin提前包含在反應mix無需預孵；

3. MAO孵育體系：僅緩沖液+底物，無輔酶，直接加酶啟動反應；

4. NAT孵育體系：三乙醇胺緩沖液+全套乙酰CoA再生組分+底物，低濃度重組酶啟動孵育。

圖3.不同家族重組酶反應孵育體系

四、實驗操作注意事項

1. 酶吸附損耗：蛋白濃度低于20μg/mL時，大量酶吸附管壁，活力明顯偏低，低濃度體系優先選用聚丙烯離心管；

2. 劇烈震蕩失活：僅移液、倒置混勻即可，較大程度渦旋、持續振蕩會破壞膜結合酶結構，大幅降低催化活力；

3. 凍融循環損傷：多次反復凍融直接導致酶活衰減，可按需分裝保存使用；

4. 有機溶劑超標抑制：嚴格遵守各酶溶劑濃度上限，高有機相不僅抑制酶活，還會改變底物溶解度，造成數據重復性差；

5. FMO特殊失活風險：無NADPH輔酶存在時，不可37℃預熱酶，必須采用“先熱體系、冷酶啟動"方案。

五、Gentest重組酶產品系列

重組酶產品系列

• CYP重組酶：456200、456201、456202等全亞型貨號；空白昆蟲對照456200/456201，b5共表達對照456244；

• UGT重組酶：456400、456407、456410等；專屬空白對照456400；

• FMO重組酶：456233、456241、456245；

• MAO重組酶：456280、456283、456284；MAO對照456280；

• NAT重組酶：456281、456282；胞質空白對照456199。

輔酶與緩沖液配套試劑

1. NADPH再生系統：451220（A液）、451200（B液）；

2. UGT專用體系：451320（5×UGT反應Mix，含alamethicin、MgCl?、Tris）、451300（UDPGA輔酶液）；

3. 基礎緩沖儲備液：451201（0.5M磷酸鉀pH7.4）。

六、常見問題FAQ

Q：為什么部分重組CYP酶分為OR和OR+b5？兩者有什么區別，該如何選型？

A：細胞色素P450氧化還原酶（OR）是CYP酶催化反應的核心還原伴侶，而細胞色素b5（b5）是重要的活力輔助因子，二者搭配體系差異明顯，嚴格遵循DLS原廠實驗機制：

• 單獨OR體系：僅共表達CYP酶與POR，可滿足基礎催化反應。適合高通量初篩、常規代謝穩定性、基礎代謝表型篩選。

• OR+b5共表達體系：同時共表達CYP、POR、細胞色素b5，蛋白組成更接近體內人肝微粒體環境。CYP3A4、CYP2C9、CYP2B6等亞型酶活性明顯受b5調控；當開展動力學試驗（Km/Vmax）、定量fm代謝組分分析、法規申報級DDI研究、底物親和力較低/代謝速率慢的化合物測試時，優先選用OR+b5，可有效規避酶活偏低、數據偏差大的問題。

2.為什么UGT實驗必須添加alamethicin，常規肝微粒體無需添加？

天然人肝微粒體中UGT酶存在潛伏活力，膜結構封閉會限制底物與酶的結合；而Gentest重組UGT酶雖大幅降低潛伏活力，但仍需alamethicin（25μg/mL）作為孔道激活劑，打通膜結構通道，釋放酶的較大催化活力，且該試劑無蛋白變性作用，不損傷酶結構，是UGT實驗數據準確的前提條件。

3.FMO和CYP底物重疊，如何通過實驗快速區分兩種代謝通路？

可通過兩大專屬特性快速區分：一是溫度敏感性，FMO熱不穩定，37℃無輔酶預處理會快速失活，CYP熱穩定性更強；二是底物偏好性，FMO優先代謝含氮、硫、磷的軟親核底物；同時可搭配熱滅活預處理、特異性化學抑制劑，準確剝離兩種通路的代謝干擾。

4.重組酶實驗中底物消耗為什么必須嚴格控制≤20%？

底物消耗超過20%會打破一級動力學平衡，引發底物耗盡、產物抑制效應，直接導致Km、Vmax、IC50、CLint等核心參數失真，無法滿足新藥IND申報的數據合規要求，是原廠明確的實驗紅線標準。

5.NAT重組酶酶活遠高于人肝胞液，實驗該如何調整參數？

NAT重組酶催化活力遠高于天然人肝胞液，無需高濃度酶體系，原廠推薦起始濃度僅0.01–0.1μg/mL，低酶濃度可避免底物快速耗盡，同時搭配專屬乙酰CoA再生體系，即可獲得線性良好、重復性佳的實驗數據。

參考文獻：

1：Fisher, M.B. et al., Drug Metab. and Disp. 28 (2000) 560-566.

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技術專欄

ADME研究、生物樣本與細胞治療應用解析專欄（可訪問曼博生物查看）

本文基于Discovery Life Sciences Gentest公開資料由其中國提供商上海曼博生物整理，用于科研信息分享、實驗參考等。上海曼博生物可提供Gentest Supersomes重組代謝酶、CYP、UGT、FMO、MAO、NAT重組酶、人/大鼠/小鼠/犬肝微粒體、NADPH再生系統、UDPGA輔酶液及相關ADMET實驗配套產品。

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