人NK細胞培養基（套裝）

人NK細胞無血清無動物成分培養基操作說明

【實驗材料】

1. KXAcF擴增液（1L，貨號：kx40-202）

2. 激活劑濃縮液（0.5ml，貨號：kx40-201）

3. 重組人白介素-2

4. 重組人白介素-15

5. 細胞培養瓶

6. 細胞培養袋

7. 人淋巴細胞分離液（Ficoll-Hypaque，比重1.077g/ml）

8. 生理鹽水或PBS（PH 7.2）

9. 注射器及其它細胞培養用材料

【操作方法】

1. 激活劑預處理

  推薦的處理方案

注意：一般而言，臍血單個核細胞濃度是外周血的一倍左右。

      通常使用的臍血采集袋中含抗凝劑 28ml/袋

1. 吸取激活劑75ul，加至1個25cm²培養瓶中。加入PBS 5ml充分混勻，使液體分散在瓶底。
2. 吸取激活劑250ul，加至1個75cm²培養瓶中。加入PBS 10ml充分混勻，使液體分散在瓶底。
3. 或吸取激活劑500ul，加至1個175cm²培養瓶中。加入PBS 20ml充分混勻，使液體分散在瓶底。
4. 或吸取激活劑1ml，加至1個250cm²培養瓶中。加入PBS 40ml充分混勻，使液體分散在瓶底。

注：飽和濃度的激活劑利于NK細胞的特異性活化。

1. 4℃活化過夜；或置于4℃冰箱保存，可儲存2周。
2. 吸除激活劑，沿培養瓶側壁加入生理鹽水，輕輕晃動培養瓶，使液體充分分散。特別強調：側壁加入生理鹽水。
3. 吸除生理鹽水，洗滌后的培養瓶應立即使用。

提示：

• 使用PBS稀釋激活劑，可維持激活劑工作液的PH值，從而保證抗體與培養瓶底的充分結合
• 必要時，可在37℃條件下反應至少1小時，但效果較差，常影響終NK細胞比例。增加激活劑活化時間，常可達到較好的效果。

2. 外周血采集

準備材料：50ml注射器，注射用肝素鈉溶液（2ml，12500U）

操作步驟：

1. 50ml注射器連接靜脈輸液針，去除輸液針保護套，抽取肝素鈉1ml浸潤管壁，推出殘留液體。
2. 肘靜脈處皮膚消毒，抽取30-50ml外周血。
3. 套上輸液針保護套，在針頭近端將軟管打結封閉靜脈輸液針。
4. 核對姓名的信息，標記。
5. 一次性鋪巾包裹注射器，至于血液標本采集箱，室溫運輸。
6. 3小時內交給實驗室技術人員。

3. 臍帶靜脈血采集

按照臍靜脈血采集常規，使用血液采集袋采集。

4. 單個核細胞分離、血漿采集及處理

1. 開啟水浴箱，調整溫度至56℃以備滅活補體。
2. 采集常規外周血、臍帶血或G-CSF動員的外周血。
3. 離心，500g，10分鐘，收集血漿。56℃，20-30分鐘滅活補體。
4. 稀釋血細胞，Ficoll-Hypaque密度梯度離心，800g（2000rpm左右），30分鐘。
5. 在收集單個核細胞層之前，將血漿離心，800g，5分鐘以上，以去除其中的血小板。
6. 收取單個核細胞層，充分混勻。離心洗滌，500g，6-10分鐘（根據液體量調整）。
7. 再次離心洗滌，500g，6-10分鐘（根據液體量調整）。
8. 用KXAcF擴增液懸浮細胞。
9. 取10ul細胞懸浮液，加入白細胞稀釋液90ul，或3%冰醋酸90ul，混勻后計細胞數。

5. 細胞培養

1)  單個核細胞懸液中加入IL-2，500-1000U/ml，IL-15，25-50ng/ml，自體血漿5-10%。細胞濃度調整至2*10⁶/ml，

A：細胞初始接種濃度是影響終NK細胞比例及細胞擴增倍數的關鍵因素之一。根據經驗，細胞終濃度2*10⁶/ml為宜。

B：某些外周血，血漿十分渾濁，其中的脂類含量過高，不利于細胞增殖。可換用混合人AB血漿。

2)  將細胞懸液加入已經預鋪板、且已經洗滌一次的培養瓶中，37℃，5%CO2和100%濕度下培養。次日，觀察是否有污染現象；如無，繼續培養，無需反復觀察。

3)  72小時后，根據細胞密度，加入適量IL-2，500-1000U/ml，IL-15，25-50ng/ml，自體血漿10%的擴增培養基。一般情況下，補充液體量為原體積的一倍。IL-2和IL-15按照補液后的總體積計算，血漿按照新培養基體積計算。

4)  繼續培養2天，培養液中補充適量含血漿5-10%，IL-2（500-1000U/ml）和IL-15（25-50ng/ml）的新鮮擴增培養基。補液量一般為原體積的一倍。

5)  之后，每天觀察細胞集落大小及密度，及時補充含血漿、IL-2和IL-15的新鮮培養基。

提示：

A：早期細胞增殖速度較慢，這與NK細胞的特異性活化有關。一般而言，NK細胞占外周血淋巴細胞的比例為5-15%，NK細胞擴增一倍，細胞總數只擴增1.2倍。因此，早期細胞總數并不能反映細胞擴增速度。

B：轉大瓶或轉袋培養是NK細胞培養的關鍵步驟之一。經過72小時培養后，部分NK細胞形成貼壁的集落；而且，這些貼壁的集落常分布于培養瓶底的邊沿。如經5-6次吹打后，NK細胞集落未脫落，則在原培養瓶中加入含5-10%血漿、IL-2（500-1000U/ml）和IL-15（25-50ng/ml）的新鮮擴增培養基繼續培養2-3天，則大部分集落可自行脫落。收集這些細胞，與其他細胞轉入大培養袋或大培養瓶中混合培養即可。

 附圖1.實際直徑接近或超過250um的NK細胞集落，集落貼壁生長。

      尺寸：100um。

6）繼續培養，直至細胞總體積超過200ml，細胞數超過2x10⁸個。此時，可轉大培養袋培養，培養體積擴大一倍。新鮮擴增培養基中含IL-2（500-1000U/ml）和IL-15（25-50ng/ml）補充自體血漿。

7）每隔2-3天補充含新鮮的血漿及細胞因子的培養基，培養12-15天細胞，達到目的用量后，可進行質量檢驗，之后收獲細胞。

提示：

A．每次補液時，均添加IL-15可提高NK細胞比例，但也增加了培養成本。

B．如在培養后期無自體血漿可用，可補充人AB血漿，但是需要滅活補體。

C．對于1.8L培養袋而言，如400ml培養基平鋪整個培養袋，則不能維系細胞間相互支持作用。建議折疊一半培養袋，使培養基集聚于另一半。依據經驗，這樣可更好的維系細胞的快速增殖。

6. 細胞收獲

1）將細胞轉移至離心管，計細胞數及細胞活力。

2）將細胞轉移至250ml離心管，離心收獲細胞，離心速度為1500rpm (500xg)，離心時間為10分鐘。

3）將細胞轉移至50ml離心管，生理鹽水懸浮，離心洗滌2次，1500rpm (500xg)，6分鐘。

4）用含1%注射用人白蛋白的生理鹽水懸浮細胞。

5）70μm細胞篩過濾細胞。

1. 留小樣備質檢。
2. 將細胞轉移至輸液袋中。靜置于室溫。

7. 注意事項

1）初始接種單個核細胞的濃度以及細胞的活性，不但影響終細胞群NK細胞比例，也影響培養過程中細胞的活性。過低的單個核細胞接種濃度，細胞增殖速度慢；過高的濃度，終細胞群中NK細胞比例低。

2）在小培養袋或大培養瓶中培養，總體積200ml，細胞總數在2*10⁸以上時，方可轉入大培養袋。否則，細胞增殖速度慢，終細胞總數低。

3）體系中持續添加IL-15，可維系NK細胞優勢擴增。

4）NK細胞增殖速度個體差異很大，轉大瓶或轉袋培養后，應密切觀察細胞生長狀態。由于NK細胞常呈集落形式增殖，細胞計數準確不高。建議根據培養基顏色（由紅色變橙色），每10x10視野中實際直徑接近或大于250um的集落平均達到3-5個，即應補加新鮮的擴增培養基。同樣，培養基中應添加適量血漿、IL-2和IL-15.

附圖2.培養基顏色和集落大小，是決定換液及換液量的關鍵因素。左圖：左側為剛補液的培養基顏色，右側為需要補液的液體顏色。右圖：a和b:大集落；c和d:小集落。