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生物上游工藝是從細胞系開發和培養到采集細胞進行擴增培養等一系列生物工藝的第一階段。
生物上游工藝包括:目的基因獲取、載體構建、載體轉化、重組子篩選(細胞分析)、培養擴增。
目的基因獲取通常有下面幾種方式:
(1)鳥(空格)槍法 (2)染色體DNA的限制性內切酶酶解 (3)人工體外合成 (4)用逆轉錄酶制備cDNA (5)PCR技術
載體構建常用載體有如下幾種:(1)質粒 (2)噬菌體DNA (3)柯斯(Cos)質粒
目的基因獲取和載體構建過程中常用設備有:
PCR儀、電泳儀、基因片段分析儀、凝膠成像系統、干浴器、組合式恒溫搖床、電轉儀、超微量分光光度計、高通量蛋白/核酸濃度粒度分析儀、掃描電子顯微鏡、高通量微量核酸濃度分析儀
載體轉化中引入寄主細胞常用兩種方法:
(1)轉化(2)轉導。實驗室常用的轉化方法有下面兩種:(1)化學轉化法(2)電轉化法
載體轉化過程中常用設備有:
CO2培養箱、水浴鍋、電轉儀、熒光倒置顯微鏡、單細胞分選儀、單克隆細胞成像驗證系統、細胞計數儀、細胞滲透壓儀、超微量分光光度計、酶標儀、洗板機、移液工作站
重組子篩選方法有:
平板篩選、顯色篩選、DNA篩選。
平板篩選包括:
(1)抗生素平板篩選(2)插入失活。
DNA篩選包括:
(1)凝膠電泳分析 (2)限制性核酸內切酶酶切分析(3)利用PCR方法篩選重組子
重組子篩選過程中細胞分析常用設備:
熒光倒置顯微鏡、單細胞組織解離器、細胞磁珠分選、單克隆細胞成像驗證系統、洗板機、移液工作站、全自動細胞熒光分析儀、小動物活體成像
培養擴增時,傳統上,整個細胞擴增過程大約需要三到四個星期,從將一小瓶活細胞轉移到一系列搖瓶中開始。
培養擴增過程中常用設備:
CO2培養箱、生物反應器組合式CO2搖床、細胞生物反應器細胞滲透壓儀、蠕動泵、倒置顯微鏡、過濾杯、手持拉曼、除菌過濾、平板過濾器、無菌儲液袋。
除上述設備外,常用公用設備包括:
純化水系統、超純水機、空壓機、恒溫循環系統溫濕度連續監測系統。
常用通用設備包括:
天平、磁力攪拌器、分散機、渦旋振蕩器、頂置式攪拌器、水浴鍋、烘箱、離心機、超聲波清洗機、實驗室洗瓶機、全自動均質機、超聲波細胞粉碎機、pH計、生物安全柜、凈氣型通風柜、冰箱、恒溫培養箱、制冰機微生物培養箱恒溫恒濕箱。
生物上游工藝中常用試劑:
血清、培養基、胰酶、大提試劑盒、PCR試劑、通用生化試劑等。
生物上游工藝中常用耗材:
細胞培養瓶、細胞工廠、移液器、吸頭、白金硅膠管、針頭過濾器、凍存管、凍存盒、方瓶、離心管、細胞培養板、移液管等。
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