細胞培養三種重要試劑總結大全！！！

                                                         檢碩科學器材（上海）有限公司

           培養基

液體培養基貯存于4 oC 冰箱，避免光照，實驗進行前放在37 oC 水槽中溫熱。 

液體培養基(加血清) 存放期為六個月，期間glutamine 可能會分解，若細胞生長不佳，  可以再添加適量glutamine。

粉末培養基配制(以1 升為例)： 

    3.1. 細胞培養基通常須添加10 % 血清，因此粉末培養基之配制體積為900 ml，pH 為  7.2 - 7.4。NaHCO3 為另外添加，若將NaHCO3 粉末直接加入液體培養基中會造成  pH 之誤差，或局部過堿。因此粉末培養基及NaHCO3 粉末應分別溶解后才混合然后用CO2 氣體調整pH，而非用強酸(HCl)或強堿(NaOH)，因為氯離子對細胞生  長可能有影響，且貯存時培養基的pH 易發生改變。 

   3.2. 材料： 

   3.2.1. 純水(milli-Q 水或二次至三次蒸餾水，水品質非常重要)  3.2.2. 粉末培養基  

   3.2.3. NaHCO3 (Sigma S-4019)  3.2.4. 電磁攪拌器  3.2.5. 無菌血清瓶  

   3.2.6. 0.1 或0.2 mm無菌過濾膜  3.2.7. pH meter  3.2.8. 真空幫浦  3.2.9. CO2 氣體    

  3.3. 步驟：

  3.3.1. 取粉末培養基溶于700 ml milli-Q 水中，攪拌使其溶解。 

   3.3.2. 稱取適量之NaHCO3 粉末(數量依培養基種類而異，表一)溶于200ml  milli-Q 水中，攪拌使其溶解，然后通入CO2 氣體至飽和，約3-5 分鐘。 

   3.3.3. 將溶解且含飽和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液體培養基中混合。混后  溶液之pH 應為7.2-7.4，除非pH 值偏差太大，否則不需用酸堿再調整之。 若為太堿，可再通入CO2 氣體調整pH。培養基以真空幫浦通過過濾膜時，  pH 會升高0.1-0.2。 

  3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 無菌過濾膜過濾滅菌，同時分裝至無菌容器中，標示培養  基種類、日期、瓶號等，貯存于4 oC。(血清亦可加入培養基中一起過濾)   

  3.3.5. 配制之培養基配制須作生長試驗與污染測試。 

  4. 配制培養基之生長測試  

  4.1. 材料： 

 4.1.1. MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004)  4.1.2. 6-well TC plate (or 35 mm TC dish)  4.1.3. methanol  4.1.4. glacial acetic acid  

4.1.5. 10 % Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013) 

  4.2. 步驟： 

  4.2.1. 以待測試培養基培養MDCK cell，接種MDCK 細胞于6-well plate (或35  mm TC dish) 中，每個well 接種1 × 102 活細胞，同時作對照組實驗。4.2.2. 接種5～7 天后，在100 倍倒立顯微鏡作觀察細胞群落之生長，待細胞群  落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸時即可。 

  4.2.3. 去除培養基，加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇：冰醋酸﹦ 3:1)，室溫下靜  置10 min。 

  4.2.4. 去除固定液，水洗二次。 

  4.2.5. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，，室溫下靜置染色2-3 min。4.2.6. 去除染液，水洗二次。 

  4.2.7. 以肉眼計數群落數，并比較之，若新配制或新批號的培養基對細胞生長不  佳，則丟棄之。

抗生素

1. 細胞庫之細胞培養基不加抗生素  

1.1. 培養自ATCC 引進之細胞株，培養基中不加抗生素。 

1.2. 培養自其它實驗室引進之細胞株，制作token freeze 前培養基須添加抗生素，待  token freeze 通過污染測試后，大量培養時則不加抗生素。 

2. 寄送活細胞時，須將培養液充滿整個flask 時，則須添加抗生素(penicillin 100 units/ml +  streptomycin 100 ug/ml)。 

3. 若要檢測mycoplasma，則培養基內不可添加gentamicin，因gentamicin 會抑制  mycoplasma 生長。 

4. 去除細菌污染之抗生素混合配方: penicillin 250 units/ml, streptomycin 250 ug/ml, neomycin  250 ug/ml, bacitracin 2.5 units/ml，注意混合使用后藥物毒性會增強。 

5. 抗生素使用種類與濃度： 

工作濃度. 儲存溫度. 殺滅細菌  

penicillin 100 units/ml -20℃ G(+) bacteria  

streptomycin 100 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria  

chlotetracycline 50 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria  

gentamicin 50 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria, mycoplasma  amphotericin B 2.5 ug/ml -20℃ yeast and molds  nystatin 50 ug/ml -20℃ yeast and molds  fungizone 2.5ug/ml -20℃ yeast and molds 

血清

1. 血清必須貯存于–20 ～ -70 oC，若存放于4℃，請勿超過一個月。如果一次無法用完一  瓶，可將40～45 ml 分裝于無菌50 ml 離心管中，由于血清結凍時體積會增加約10 %，  必須預留此膨脹體積之空間，否則易發生污染或容器凍裂之情形。 

2. 一般廠商提供之血清為無菌，不需再無菌過濾。若發現血清有許多懸浮物，則可將血清加  入培養基內一起過濾，勿直接過濾血清。 

3. 瓶裝(500ml) 血清解凍步驟(逐步解凍法): -20 oC 或–70 oC 至4 oC 冰箱溶解一天，至室  溫下全溶后再分裝，一般以50 ml 無菌離心管可分裝40～45 ml。在溶解過程中須規則搖  晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一，減少沈淀的發生。勿直接由–20 oC 直接  至37 oC 解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質凝結而發生沈淀。 

4. heat-inactivation 是指56 oC, 30 分鐘加熱已*解凍之血清。加熱過程中須規則搖晃均  勻。此熱處理之目的是使血清中之補體成份(complement) 去活化。除非必須，一般不建  議作此熱處理，因為會造成沈淀物之顯著增多，且會影響血清之品質。補體參與之反應有：cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and  platelets, enhanced phagocytosis, chemotaxis and activation of lymphocytic and macrophage cell  type。

5. 勿將血清置于37 oC 太久，若在37 oC 放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較  不穩定之成份亦會因此受到破壞，而影響血清之品質。 

 6. 血清之沈淀物  

6.1. 凝絮物：發生之原因有許多種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 變性  及解凍后血清中存在之血纖維蛋白(fibrin) 造成，這些凝絮沈淀物不會影響血清本  身之品質。若欲減少這些凝絮沈淀物，可用離心3000 rpm, 5 min 去除，或離心后上  清液可以加入培養基中一起過濾。不建議用過濾步驟去除這些凝絮沈淀物，因為會  阻塞過濾膜。 

6.2. 顯微鏡下觀察之“小黑點"：通常經過熱處理之血清，沈淀物的形成會顯著的增多。 有些沈淀物在顯微鏡下觀察像是“小黑點"，常會誤認為血清遭受污染，而將血清  放在37 oC 中欲培養此“微生物“，但在37 oC 環境下，又會使此沈淀物增多，更  會誤認為微生物之增殖，但以培養細菌之培養基檢測，又沒有污染。一般而言，此  小黑點應不會影響細胞之生長，但若懷疑此血清之品質，應立即停用，更換另一批  號的血清。

7. 血清之生長測試  7.1. 材料： 

7.1.1. MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004)  

7.1.2. a-MEM (alpha modified minimal essential medium, GibcoBRL 12000-022 )  7.1.3. 6-well TC plate (or 35mm TC dish)  7.1.4. methanol  7.1.5. glacial acetic acid  

7.1.6. 10 % Giemsa solution(GibcoBRL 10092-013)  7.2. 步驟： 

7.2.1. 以a-MEM with 10 % FBS (已測試過) 培養MDCK 細胞于T75 flask 至80  % confluency。 

7.2.2. 以trypsin-EDTA 處理細胞，離心后，加入適量不加血清之a-MEM 制成細  胞懸浮液，并測細胞濃度。以不加血清之a-MEM 稀釋細胞濃度為1×102 活  細胞數/ ml。 

7.2.3. 將1 ml 細胞懸浮液接種入6-well plate 中，并另加入1 ml 含不同濃度的血 

清(20 % , 10 % , 4 % , 2 % , 1 % , 0.4 %) 之a-MEM，使血清最終濃度為10  % , 5 % , 2 % , 1 % , 0.5 % , 0.2 %。用已測試過之血清同時進行對照組試驗。7.2.4. 37 oC，5 % CO2 培養箱培養5-7 天，期間不需更換培養基，待細胞群落大  到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸即可。 

7.2.5. 去除培養基，加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇:冰醋酸﹦ 3:1)，室溫下靜  置10 min。 

7.2.6. 去除固定液，水洗二次。

7.2.7. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，，室溫下靜置染色2-3 min。7.2.8. 去除染液，水洗二次。7.2.9. 以肉眼計數群落數  

7.2.10. 計算SPE ( Serum Plating Efficiency )：SPE = ( no. of colonies / well ) / 100 x 100 %  7.2.11. 計算RPE(Relative Plating Efficiency)： 

SPE = [ total colonies of six well (test) / Total colonies of six well (control) ] x100 %  7.3. 比較各濃度血清培養基之RPE，即可得知待測血清對細胞生長的影響。7.4. 訂購多量同一批號的優良血清，置于–70 oC 保存之