LF50 倒置熒光顯微鏡 Calcein AM-PI 活 / 死細胞雙色熒光染色檢測完整解決方案

一、方案概述

1.1 Calcein AM-PI 雙色染色檢測原理

Calcein AM-PI 雙染法是細胞原位活力觀測經典雙色熒光技術，依托細胞酯酶活性與細胞膜完整性雙重指標區分活、死細胞：

1.       Calcein AM（綠色熒光，FITC 通道，激發 / 發射 494/517nm）

脂溶性小分子，可自由穿透所有細胞膜；活細胞內存在活性酯酶，水解 AM 疏水基團，生成帶電荷鈣黃綠素滯留細胞質，發出明亮綠色熒光；死細胞無功能性酯酶，無綠色熒光信號。

2.       PI 碘化丙啶（紅色熒光，TRITC/Cy3 通道，激發 / 發射 535/617nm）

無法穿透完整活細胞膜，僅進入膜破損死細胞，結合細胞核核酸產生紅色核熒光。

細胞判定標準：

活細胞：細胞質綠色熒光，細胞核無紅色信號；

死細胞：細胞核紅色熒光，細胞質無綠色熒光；

晚期凋亡、重度損傷細胞：紅綠雙熒光陽性。

1.2 LF50 倒置熒光顯微鏡適配本實驗核心硬件優勢

萊特 LF50 緊湊型倒置熒光顯微鏡專為細胞培養原位熒光成像設計，無限遠校正光學系統、超長工作距離聚光、電動多通道 LED 熒光系統匹配 Calcein AM-PI 雙通道染色觀測需求，核心適配亮點如下：

1.       超長可調工作距離聚光系統，兼容全規格細胞培養容器

LF50 聚光鏡標準工作距離 72mm，可拆卸拆除后縱向空間可達 160mm，可直接觀測多層細胞工廠、大尺寸培養皿、6/12/24 孔板，無需開蓋、無需轉移爬片，原位染色觀測減少細胞脫落損傷，適配高通量細胞活力篩查。

（配圖：圖 1 LF50 整機正面實拍；圖 2 72mm 標準工作距離示意圖；圖 3 拆卸聚光鏡后 160mm 超大空間觀測細胞工廠實拍）

LF50整機圖

72mm工作距離

聚光鏡可拆卸結構

2.       電動五通道 LED 熒光激發盒，精準匹配 Calcein、PI 雙染料通道

LF50 搭載集成式電動 LED 熒光激發模塊，標配 DAPI、FITC、TRITC 三組標準濾光片組，FITC 通道采集 Calcein 活細胞綠色信號，TRITC 通道采集 PI 死細胞紅色信號；LED 光源即開即用無預熱，亮度無級可調、光毒性極低，支持長時間活細胞動態追蹤拍攝；整機最多擴展 5 組熒光通道，可按需定制 Mcherry、CY5 等濾光片，后續可拓展三色共定位實驗。

（配圖：圖 4 電動熒光激發盒；圖 5 Calcein-PI 雙色細胞熒光成像效果圖）

電動熒光盒

雙色熒光成像圖

3.       22mm 超大視場三目觀察筒，大幅提升樣本篩選效率

配備 WF10X/22mm 平場大視場目鏡，對比常規 18/20mm 視場目鏡，單視野容納更多細胞，快速定位目標觀測區域；30° 可 360° 旋轉鉸鏈三目筒，瞳距 48-75mm 大范圍可調，高眼點人體工學設計，長時間熒光觀測緩解頸肩疲勞；三目分光結構目視觀察與數碼成像同步進行，無需反復切換光路。

（配圖：圖 6 360° 旋轉三目筒；圖 7 18/20/22mm 視場范圍對比圖）

旋轉三目筒

視場對比示意圖

4.       大尺寸多功能載物臺，柔性低位移動手柄操作便捷

固定載物臺尺寸 235×200mm，XY 軸移動行程 123×78mm，搭載可拆卸柔性 XY 低位移動手柄，拆卸后臺面完平整，可放置超大培養皿；配套多功能培養皿托板，兼容培養瓶、多孔板、細胞工廠；機身配備快拆裝熒光護目板，阻擋強激發光保護實驗人員眼部。

（配圖：圖 8 LF50 多功能載物臺；圖 9 可拆卸移動手柄結構）

多功能載物臺

載物臺側視結構

5.       推拉式多通道相差模塊，明場 / 相襯 / 熒光三位一體觀測

聚光中部雙向推拉相差板，同時搭載 10X/20X/40X 三組相差環，染色前可通過相差清晰觀察細胞鋪板密度、細胞形態；染色后同步采集相差明場、Calcein 綠色、PI 紅色三組圖像，實現細胞形態 + 細胞活力同步分析，實驗數據維度更完整。

（配圖：圖 10 推拉式相差環板；圖 11 相差模式細胞成像圖）

相差環推拉板

相差細胞圖像

6.       一體化高靈敏度數碼成像系統，自動完成活死細胞定量

標準 C-MOUNT 成像接口，支持 230 萬 - 2100 萬全系列高靈敏度熒光相機，左下側成像結構不遮擋目視觀測；配套專業顯微成像軟件免費升級，可自動完成雙通道圖像疊加、活 / 死細胞分割、細胞數量、存活率自動統計，批量導出圖像與 Excel 數據報表。

（配圖：圖 12 LF 系列顯微成像相機套裝；圖 13 相機安裝整機實拍）

顯微相機套裝

相機安裝實拍

7.       低手位同步同軸調焦，長時間熒光觀測不易失焦

機身左右同步同軸調焦手輪，粗調扭矩松緊可調，配備高程限位鎖定功能，微調精度 0.001mm，高倍 40X 熒光物鏡觀測時對焦穩定，避免反復調焦造成熒光淬滅，適配批量多孔板連續成像。

（配圖：圖 14 LF50 調焦手輪細節）

調焦手輪

二、實驗前期準備

2.1 試劑與耗材清單

1.       Calcein AM-PI 活死細胞雙色染色試劑盒；

2.       無血清基礎培養基（DMEM/RPMI 1640）、細胞培養基；

3.       無菌 PBS 磷酸鹽緩沖液；

4.       6 孔、12 孔、24 孔細胞培養板、細胞培養皿、多層細胞工廠；

5.       避光無菌離心管、多通道移液槍、避光孵育盒、無菌吸頭。

2.2 LF50 顯微鏡上機調試操作步驟

1.       整機通電，依次打開機身總電源、透射 LED 照明、電動熒光激發盒電源；LF50 全 LED 光源無需預熱，開機即可直接使用。

2.       根據樣本規格調整聚光結構：單層多孔板、標準培養皿保留聚光鏡（72mm 工作距離）；多層細胞工廠拆卸聚光鏡，獲得 160mm 超大縱向空間。

3.       推拉相差板至空白檔位（明場模式），選用 10X 長工作距離相差物鏡，調節同軸調焦手輪至限位歸零，鎖定高程。

4.       操作電動熒光盒切換 FITC、TRITC 通道預檢查，熒光亮度統一調至 30% 基礎檔位，避免熒光信號過曝丟失細胞細節。

5.       根據培養容器規格安裝對應載物托板，拆卸移動手柄放置超大培養皿，固定防滑動卡扣。

三、標準化完整實驗操作流程

3.1 貼壁細胞樣本預處理

1.       取出完成藥物、氧化應激、缺氧等造模處理的細胞培養板，緩慢吸除原有細胞培養基；

2.       加入無菌 PBS 輕柔洗滌細胞單層 1 次，清除血清殘留（血清含游離酯酶會提前分解 Calcein AM，大幅提升背景熒光干擾成像）；

3.       洗滌完成后吸凈孔內 PBS 殘留，防止稀釋染色工作液降低染色效率。

3.2 Calcein AM-PI 染色工作液避光配制（現配現用）

以 24 孔板單孔 250μL 體系為例：

取 250μL 無血清培養基，依次加入 Calcein AM 母液、PI 母液，稀釋至終濃度 Calcein AM 2~5μM、PI 1~2μM，充分吹打混勻，全程避光操作，配制完成后立即使用。

3.3 細胞避光孵育染色

1.       向每孔細胞中加入配制完成的染色工作液，液體覆蓋細胞單層；

2.       將培養板放入 37℃恒溫避光細胞孵育箱，避光孵育 15~30min；

3.       懸浮細胞處理方式：離心收集細胞沉淀，使用染色工作液重懸細胞，避光孵育后滴加至培養皿內上機觀測。

3.4 LF50 顯微鏡雙通道熒光成像標準操作

1.       樣本放置：取出避光孵育完成的細胞培養板，無需再次洗滌（防止貼壁細胞脫落），平穩放置于 LF50 多功能載物臺，鎖緊托板卡扣防止滑動。

2.       相襯預定位：推拉相差板切換至 10X PH 相差環，開啟透射 LED 光源，粗調 + 微調同軸調焦手輪，找到清晰細胞視野，標記目標觀測區域。

3.       采集活細胞綠色熒光通道（FITC）：電動熒光盒一鍵切換 FITC 激發通道，緩慢上調熒光亮度至細胞輪廓清晰無過曝；推拉三目成像切換拉桿切換數碼成像模式，采集單通道綠色熒光圖像。

4.       采集死細胞紅色熒光通道（TRITC）：電動切換 TRITC 激發通道，匹配紅色細胞核熒光亮度，采集單通道紅色熒光圖像。

5.       多通道圖像疊加：成像軟件自動合并相差明場、綠色 Calcein、紅色 PI 三通道圖像，直觀區分活細胞、死細胞空間分布。

6.       高倍細節拍攝：切換 20X/40X 長工作距離熒光物鏡，精細微調對焦，拍攝單細胞活死狀態、細胞凋亡細節圖像。

3.5 圖像采集與細胞活力定量統計分析

1.       打開配套顯微成像軟件，軟件自動識別綠色 Calcein 陽性活細胞、紅色 PI 陽性死細胞，自動分割細胞輪廓去除背景雜光；

2.       軟件自動統計單視野總細胞數量、活細胞數量、細胞存活率，支持多視野批量數據匯總；

3.       批量保存原始單通道圖像、多通道疊加合成圖、數據統計報表，一鍵導出 Excel 實驗數據，軟件免費升級無額外收費。

四、LF50 設備操作規范與注意事項

1.       熒光觀測全程避光：染色樣本避免室內強光直射，熒光 LED 亮度由低至高逐步調節，單次觀測時間不宜過長，防止 Calcein 熒光淬滅。

2.       聚光鏡使用規范：觀測多層細胞工廠必須拆卸聚光鏡，保證 160mm 縱向空間，避免物鏡碰撞培養容器造成硬件損壞；常規單層樣本保留聚光鏡提升成像亮度。

3.       物鏡防護規范：載物臺平整結構減少培養液濺落，若液體不慎滴落物鏡表面，立即使用專業無塵鏡頭紙輕輕擦拭，禁止用水直接沖洗物鏡鏡片。

4.       長時間活細胞動態拍攝優化：降低熒光 LED 輸出亮度，縮短圖像單次曝光時間；LF50 低光毒性 LED 光源可支持 0.5~1 小時連續動態拍攝，細胞損傷程度極低。

5.       批量多孔板檢測優化：電動熒光激發盒支持電腦軟件聯動自動切換熒光通道，批量多孔樣本可設置程序自動輪換通道采集，大幅提升高通量篩查效率。

6.       護目板使用：長時間熒光觀測時安裝快拆裝護目板，阻擋強激發光直射眼部，保護操作人員視力。

五、LF50 搭配 Calcein AM-PI 對比 AOP 染色方案優勢

1.       細胞安全性優勢：Calcein AM 染料細胞毒性極低，染色完成后的細胞可放回孵箱繼續培養開展后續增殖、給藥實驗；AO 吖啶橙存在遺傳毒性，染色后細胞無法復用，LF50 長時間活細胞動態成像僅適配 Calcein AM-PI 檢測體系。

2.       成像信號優勢：Calcein 均勻標記細胞質，搭配 LF50 22mm 大視場光學系統，可同步觀察細胞形態與活力；AO 僅標記細胞核酸，細胞碎片、凋亡小體、游離核酸均會被染色，容易造成細胞計數結果偏高、誤差大。

3.       樣本兼容優勢：LF50 可拆卸超長工作距離聚光系統支持細胞工廠、3D 細胞球、類器官等厚層立體細胞樣本原位成像；AOPI 法僅適合懸浮細胞快速計數，無法觀測厚層立體細胞模型。

4.       實驗拓展優勢：LF50 五通道電動熒光模塊可額外疊加 DAPI 核染色，實現 Calcein/PI/DAPI 三色熒光共定位，拓展細胞凋亡、共培養細胞活力、干細胞鑒定等多元化檢測實驗。

六、本方案適用實驗場景

本套 LF50 倒置熒光顯微鏡 + Calcein AM-PI 雙染標準化解決方案，適用于以下機構與實驗項目：

1.       高校、科研院所細胞生物學實驗室：細胞氧化損傷、缺氧模型、藥物毒性評價；

2.       藥企藥效篩選平臺：抗腫瘤、細胞保護類藥物高通量細胞活力篩查；

3.       干細胞、原代細胞實驗室：干細胞活性、原代細胞存活鑒定；

4.       3D 細胞球、類器官、多層細胞工廠高通量培養活力檢測；

5.       醫療衛生、檢驗檢疫、農牧乳業細胞相關安全檢測項目；

6.       高校教學實驗室細胞熒光成像基礎教學。

七、LF50 電動熒光標準配置清單

1.       LF50 無限遠獨立校正倒置熒光顯微鏡主機

2.       30° 可 360° 旋轉鉸鏈三目觀察筒，瞳距 48-75mm，高眼點設計

3.       WF10X/22mm 平場大視目鏡，配套對中望遠鏡

4.       長工作距離平場相差熒光物鏡：4X、10X PH、20X PH、40X PH

5.       可拆卸超長工作距離聚光鏡，標準 72mm，拆卸后 160mm，N.A 0.30

6.       雙向推拉式相差環板，搭載 10X/20X/40X 專用相差環

7.       電動五通道 LED 熒光激發盒，標配 DAPI、FITC、TRITC 三色熒光濾光組

8.       235×200mm 大尺寸多功能載物臺，可拆卸柔性 XY 低位移動手柄

9.       5W 可調暖色透射 LED 照明系統，配套黃、綠、藍濾色片

10.       5/6 孔外傾斜物鏡轉盤，滾珠內定位，內置防霉裝置

11.       2100 萬像素高靈敏度熒光顯微相機，配套免費成像分析軟件

12.       快拆裝熒光護目板、全套培養皿 / 多孔板 / 細胞工廠專用托板

八、方案綜合總結

萊特 LF50 緊湊型倒置熒光顯微鏡依托可拆卸超長工作距離聚光系統、電動多通道低光毒性 LED 熒光模塊、22mm 超大視場人體工學三目筒、三合一相差明場熒光觀測、一體化數碼定量成像五大核心硬件優勢，適配 Calcein AM-PI 活死細胞雙色熒光原位染色成像需求。整套標準化方案實現細胞樣本原位染色、相襯預定位、雙通道熒光圖像采集、細胞活力自動定量全流程閉環操作，兼容單層多孔板、大培養皿、多層細胞工廠、3D 類器官等各類細胞樣本，同時支持長時間活細胞動態追蹤觀測。

對比進口同級別倒置熒光設備，LF50 具備機身緊湊占用空間小、全 LED 光源節能環保、國產化高性價比、售后、成像軟件免費升級等突出優勢，是高校、藥企、科研院所細胞活力熒光檢測、高通量藥物篩選的經濟型一站式標準化成像解決方案。