LF50倒置熒光顯微鏡在活/死細(xì)胞
雙色熒光染色（AO/PI 法）檢測(cè)中的應(yīng)用解決方案

基于緊湊型 LED 熒光激發(fā)與直立三目數(shù)碼觀察的規(guī)范化細(xì)胞活性評(píng)估指南

圖 1：萊特 LF50 倒置熒光顯微鏡整機(jī)結(jié)構(gòu)與數(shù)碼成像系統(tǒng)

一、 應(yīng)用背景與 AO/PI 雙色熒光檢測(cè)原理

在細(xì)胞毒理學(xué)、原代細(xì)胞分離提取、免疫學(xué)評(píng)估及細(xì)胞工程研究中，精準(zhǔn)測(cè)定細(xì)胞懸液或培養(yǎng)物中的活細(xì)胞與死細(xì)胞比例是核心環(huán)節(jié)。吖啶橙（Acridine Orange, AO）與碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）聯(lián)合使用的 AO/PI 雙色熒光染色法，能夠特異性鑒定細(xì)胞質(zhì)膜的完整性。相比于傳統(tǒng)臺(tái)盼藍(lán)（Trypan Blue）明場(chǎng)染色，AO/PI 染色法能有效排除原代樣品中的無(wú)核碎片、紅細(xì)胞及雜質(zhì)干擾，大幅提升計(jì)算結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.1 AO 與 PI 熒光探針的作用機(jī)制

二、 LF50倒置熒光顯微鏡核心硬件與技術(shù)支撐

萊特 LF50 倒置熒光顯微鏡采用無(wú)限遠(yuǎn)獨(dú)立校正光學(xué)系統(tǒng)與高穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，為 AO/PI 熒光活死細(xì)胞檢測(cè)提供了契合的技術(shù)硬件支撐：

2.1 緊湊光源/激發(fā)一體化 LED 熒光系統(tǒng)（手動(dòng)/電動(dòng)可選）

LF50 采用了光源與激發(fā)塊一體化的緊湊型 LED 熒光激發(fā)盒，內(nèi)置大功率高亮 LED 光源，支持無(wú)級(jí)調(diào)光，可實(shí)現(xiàn)即開即用（無(wú)傳統(tǒng)汞燈預(yù)熱與冷卻等待的困擾）。系統(tǒng)最多支持 5 通道擴(kuò)展，標(biāo)配包含 FITC（GFP）、TRITC（CY3）及 DAPI 三色濾光組，能夠準(zhǔn)確匹配 AO（綠色）與 PI（紅色）的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)。電動(dòng)款激發(fā)盒還配有液晶顯示屏，支持光強(qiáng)記憶與軟件控制。

圖 2：LF50 緊湊光源/激發(fā)一體化 LED 熒光激發(fā)盒（帶無(wú)級(jí)調(diào)光與通道顯示）

圖 3：LF50 匹配的高透光率 FITC / TRITC / DAPI 熒光濾光塊

2.2 72mm 超長(zhǎng)工作距離聚光鏡與護(hù)目板設(shè)計(jì)

LF50 配備 72mm 超長(zhǎng)工作距離聚光鏡（數(shù)值孔徑 N.A. 0.30），帶可調(diào)光欄與非球面鏡片，提供均勻一致的相襯照明。當(dāng)拆卸聚光鏡后，縱向工作空間可拓展至 160mm，方便直接承載大型培養(yǎng)皿或細(xì)胞工廠。此外，LF50 配有快拆裝護(hù)目板，能有效濾除強(qiáng)激發(fā)光的反射，保護(hù)實(shí)驗(yàn)人員的眼睛。

圖 4：LF50 護(hù)目板與 72mm 超長(zhǎng)工作距離聚光系統(tǒng)

2.3 30° 傾斜三目觀察筒與 0.001mm 高精度低手位調(diào)焦

LF50 配備 30° 傾斜鉸鏈?zhǔn)饺坑^察筒，支持 360° 旋轉(zhuǎn)與大范圍瞳距調(diào)節(jié)（48–75mm），配合 WF10X/22mm 平場(chǎng)大視野目鏡，提供舒適的觀視體驗(yàn)。調(diào)焦機(jī)構(gòu)采用左右同軸低手位手輪，微調(diào)精度高達(dá) 0.001mm（行程 15mm），帶限位與鎖緊裝置，可實(shí)現(xiàn)快速精準(zhǔn)對(duì)焦。

圖 5：LF50 30° 傾斜三目筒與低手位同軸調(diào)焦機(jī)構(gòu)

2.4 直立頂置三碼接口與高畫質(zhì)顯微相機(jī)

LF50 采用直立頂置三目 C-MOUNT 成像接口（分光比 0:100 / 100:0），支持掛載 230–2500 萬(wàn)像素高靈敏度數(shù)碼顯微相機(jī)。結(jié)合專用配套軟件，可實(shí)現(xiàn)電腦端實(shí)時(shí)預(yù)覽、低照度熒光圖像采集及自動(dòng)化圖像疊加分析。

圖 6：LF50 頂置三目接口連接高畫質(zhì)數(shù)碼顯微相機(jī)

三、 AO/PI 雙色熒光檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)解決方案流程

為了在 LF50 顯微鏡下獲得低背景噪聲、對(duì)比度清晰的雙色熒光圖像及準(zhǔn)確的細(xì)胞活性數(shù)據(jù)，推薦采用以下標(biāo)準(zhǔn)化操作流程：

步驟 1：試劑配制與樣品準(zhǔn)備

• 工作液配制：使用無(wú)熒光背景的 PBS 緩沖液將 AO 與 PI 儲(chǔ)存液稀釋為雙染色工作液（建議終濃度：AO 約 5–10 μg/mL，PI 約 10–20 μg/mL），避光保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。

• 細(xì)胞洗滌：取待測(cè)貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞或原代懸液，用溫育的 PBS 輕輕洗滌 1–2 次，消除培養(yǎng)基成分及殘余血清干擾。

步驟 2：樣品混合染色與孵育

• 混合染色：將 AO/PI 混合工作液與細(xì)胞懸液按 1:1 比例充分混合（或直接加入培養(yǎng)板孔中），確保染色液均勻覆蓋細(xì)胞。

• 避光溫育：室溫避光孵育 5–10 分鐘。由于 AO/PI 與核酸結(jié)合迅速，建議在 20 分鐘內(nèi)完成上樣與采集。

步驟 3：LF50 快速上樣與相襯聚焦

• 樣品放置：將染色后的血球計(jì)數(shù)板、載玻片或培養(yǎng)皿置于 LF50 載物臺(tái)上，使用加粗固定夾固定。

• 明場(chǎng)/相襯定位：開啟 LED 明場(chǎng)光源，推動(dòng)相差板切入對(duì)應(yīng)相襯環(huán)（如 10X 或 20X），利用 0.001mm 高精度微調(diào)手輪快速找到代表性視野焦面。

步驟 4：多通道熒光圖像采集

• FITC 通道采集（活細(xì)胞）：將熒光激發(fā)盒切換至 FITC 綠光通道，開啟 LED 熒光激發(fā)，采集綠色胞質(zhì)/胞核熒光圖像（綠光細(xì)胞為活細(xì)胞）。

• TRITC 通道采集（死細(xì)胞）：切換至 TRITC 紅光通道，系統(tǒng)還原預(yù)設(shè)光強(qiáng)，采集紅色胞核熒光圖像（紅光細(xì)胞為死細(xì)胞/膜受損細(xì)胞）。

步驟 5：圖像合成與細(xì)胞存活率分析

• 圖像傳輸與疊加：通過(guò)頂置三目接口掛載的顯微相機(jī)傳輸數(shù)據(jù)，利用配套軟件對(duì) FITC 與 TRITC 圖像進(jìn)行 Overlay/Merge 通道疊加。

• 活性定量計(jì)算：分別統(tǒng)計(jì)全視野內(nèi)的綠光活細(xì)胞數(shù)（Live）與紅光死細(xì)胞數(shù)（Dead），計(jì)算細(xì)胞存活率：Vitality (%) = [Live / (Live + Dead)] × 100%。

四、 典型圖像結(jié)果與數(shù)據(jù)評(píng)估

在 LF50 高質(zhì)光學(xué)系統(tǒng)與高信噪比 LED 熒光光路支持下，AO/PI 染色呈現(xiàn)出界限分明的形態(tài)與光譜特征：

圖 7：LF50 下采集的高信噪比多通道細(xì)胞熒光圖譜（亮視野與低背景噪點(diǎn)）

五、 規(guī)范操作注意事項(xiàng)與設(shè)備保養(yǎng)建議

5.1 染色時(shí)間控制：染色混合后建議在 20 分鐘內(nèi)完成熒光觀察與圖像采集。孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能導(dǎo)致 AO 濃度變化或 PI 被活細(xì)胞內(nèi)吞造成假陽(yáng)性。

5.2 激發(fā)光功率調(diào)節(jié)：利用 LF50 熒光激發(fā)盒的無(wú)級(jí)調(diào)光與光強(qiáng)記憶功能，在拍攝強(qiáng)度滿足的前提下適當(dāng)調(diào)低 LED 激發(fā)功率，以減緩熒光漂白。

5.3 護(hù)目板規(guī)范使用：在強(qiáng)激發(fā)光觀察時(shí)請(qǐng)拉出護(hù)目板，保護(hù)實(shí)驗(yàn)人員視力健康。

5.4 鏡片維護(hù)保養(yǎng)：半復(fù)平場(chǎng)消色差物鏡透鏡表面需定期檢查，若沾有灰塵或培養(yǎng)基，應(yīng)用氣吹或?qū)Ｓ玫臒o(wú)塵紙沾取無(wú)水乙醇輕輕擦拭，保持優(yōu)良的透光性能。